坛紫菜膳食纤维的响应面优化超声复合酶法提取及其对鱼糜凝胶强度的影响.docx

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1、摘要:为促进坛紫菜P“pAdAa/衣es/s高附加值产品的开发，提高坛紫菜的综合利用率，以坛紫菜为原材料，利用超声波破碎仪结合Q-淀粉酶(质量分数1.0%).糖化酶(质量分数1.0%)及中性蛋白酶(质量分数1.0%)酶法提取可溶性膳食纤维(SoIUbIedietaryfiber,SDF),并在单因素试验基础上，以可溶性膳食纤维提取率为响应值，选取酶解温度(A)、超声时间(B)、超声功率(C)设置3因素3水平进行Box-Behnken优化试验，并对添加SDF的冻藏罗非鱼鱼糜的凝胶强度及组织结构进行了观察。结果表明：优化得出的最佳提取条件为酶解温度50、超声时间40min、超声功率为450W,在此

2、条件下SDF的提取率为23.96%0.80%,与预期结果基本一致；测得坛紫菜SDF持水率为(4.680.08)gg,膨胀力为(2110.11)m1g,持油率为060.05)gg,阳离子交换力为(1280.13)mmo1g;分别以质量分数为0.1%0.2%、0.3%的SDF添加至罗非鱼鱼糜中，0.2%添加量组罗非鱼鱼糜凝胶强度降幅为51.21%(空白组降幅为79.55%),且鱼糜凝胶空间结构最为致密均匀。研究表明,采用超声波辅助酶法能够显著提高坛紫菜SDF的提取率和品质,所得SDF可显著减缓鱼糜凝胶强度降低的程度。关键词：坛紫菜；超声波辅助酶法；响应面法；鱼糜坛紫菜Porphyrahaitane

3、nsis,俗称紫菜、乌菜，是中国特有的一种可人工栽培的海藻。藻体单层，局部双层，色素体单一或少数具双，基部细胞呈圆头形，雌雄异株，少数同株，属暖温带性种类，为中国浙江、福建和广东沿海的主要栽培藻类。坛紫菜富含蛋白质、多糖和维生素，可供食用或药用。此外，坛紫菜中还富含较高的膳食纤维成分,膳食纤维又有“人体第七营养素”之称。膳食纤维按照其溶解性分为可溶性膳食纤维(SO1UbIedietaryfiber,SDF)和不可溶性膳食纤维(inso1ub1edietaryfiber,IDF),SDF在生理功能方面比IDF更为出色，具有缓解糖尿病、降低高血压血脂、预防心血管疾病等功能。目前，SDF的提取方式主

4、要有粗分离法、化学提取法、酶法等，粗分离法是利用液体悬浮法和气流分级法，将原料中各成分的相对含量改变，从而提高膳食纤维含量，此方法得到的膳食纤维纯度不高，一般可作为原料的预处理；化学提取法包括水法、酸法、碱法及絮凝法，该方法得到的膳食纤维纯度较高，也比较适用于工业化生产，但酸和碱不仅会在一定程度上破坏膳食纤维结构，且对设备要求高，也会对环境造成污染；酶法是用一种或多种酶去除原料中除膳食纤维外的其他成分，通过浓缩、过滤、干燥得到膳食纤维，酶法提取专一性强，作用条件温和，操作方便，有利于环境保护，得到的膳食纤维纯度高。植物多糖提取时常采用超声波破碎处理提高其提取率，但目前联合使用超声波及蛋白酶酶解

5、提取海藻膳食纤维鲜见报道。本试验中，在酶法提取基础上采用超声波破碎仪对坛紫菜细胞结构进行破坏，使酶能够更充分地接触物料，从而提高水溶性膳食纤维的提取率，为提升坛紫菜资源高值化利用率提供科学参考。1材料与方法1.1 材料试验用坛紫菜购自福建东山，罗非鱼鱼片购自广州禄仕食品有限公司。试验试剂：无水乙醇、氢氧化钠、丙酮及其他试剂（分析纯，广州化学试剂厂）；a-淀粉酶（活性210000Ug,So1arbio）；糖化酶（活性2100000Ug,北京奥博星生物技术有限责任公司）；中性蛋白酶（活性260000Ug,北京奥博星生物技术有限责任公司）。试验仪器：电热恒温鼓风干燥机（上海一恒科技有限公司）；真空抽

6、滤机（力辰科技有限公司）；粉碎机（永康红太阳机电有限公司）；超声波破碎仪（上海沪析实业有限公司）；高速离心机（美国贝克曼库尔特公司）;旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；QTS-25型质构仪（英国CNSFARNE11公司）；PhenomPro型桌面式扫描式电子显微镜（美国赛默飞世尔科技公司）。1.2 方法1.2.1 提取步骤参考孟爽爽的方法，略做改进。将坛紫菜样品放入粉碎机粉碎后，过245Um筛密封备用，取坛紫菜粉按一定质量比加入蒸储水于超声波破碎仪破碎，调节PH为5后加入Q-淀粉酶、糖化酶反应，沸水浴10min灭酶活，冷却后调节PH为7,加入中性蛋白酶反应，再次沸水浴10min灭酶活，之后以1

7、0000r/min离心10min,取上清液加入4倍体积的乙醇（体积分数为95%）,沉淀24h后抽滤，置于60下烘干，得到SDF。1.2.2 单因素试验设定准确称取5.Og坛紫菜粉末，按照质量比1：25加入蒸储水。先于超声波破碎仪中破碎，再进行酶解，最后进行离心、醇沉（条件同上）。为了更好地探究各因素对坛紫菜水溶性膳食纤维提取的影响，在查阅相关文献后，设置5个影响单因素，分别是超声功率（270、360、450、540、630W）,超声时间（20、30、40、50、60min）,中性蛋白酶添加量（0.遥、0.5%、10%、1.5%、2.0%,均为质量分数，下同），酶解温度（30、40、50、60、

8、70）,酶解时间（20、40、60、80.100min）o试验结果以水溶性膳食纤维提取率为衡量指标，提取率（%）计算公式为1.2.3响应面优化提取条件采用Dsign-Expert8.0.6.1软件，按照Box-Behnken试验设计，在单因素基础上选取酶解温度（A）、超声时间（B）、超声功率（03个因素作为自变量，提取率为响应值，进行响应面分析设计试验（表1）。表1BoX-Behnken试验设计因素水平及编码表Tab.1Factors,1eve1sandcodetab1eusedinBox-Behnkendesign水平1eve1因索factorA酶解温度icenzymeso1utiontem

9、peratureB超声时间minu1trasonictime-1403005040160501.2.4坛紫菜SDF理化性质测定持水性(gg)、膨胀力(1g)、持油性(g/g)、阳离子交换力(mmo1g)计算公式分别为持水率二离心后离心管质量(g)-干燥离心管质量(g)/SDF干质量(g),(2)膨胀力二吸水后体积(HI1)-初始体积(m1)SDF质量(g),(3)持油率二样品结合油后质量(g)-样品干质量(g)/样品干质量(g),(4)阳离子交换力=消耗NaOH体积(m1)-空白体积(m1)/样品质量(g)XNaOH浓度(mo11)o(5)1.2.5SDF对冻藏鱼糜凝胶强度的影响分别将质量分数

10、为0.1%、0.2%,0.3%的坛紫菜SDF干样与罗非鱼鱼片斩拌15min后，制成混合鱼糜，置于-20C条件下冻藏，并设置空白组。将冻藏下的鱼糜解冻，搅碎后加入质量分数2.5%的NaCI擂溃5min,灌入肠衣待用。然后在40下加热30min,再于90下加热15min,二段加热使其凝胶化,冷却至室温后置于4C冰箱过夜，待测。将过夜样品取出切成25mm高的圆柱体，用质构仪测定凝胶强度。质构仪参数设置为：球形探头直径为5mm,下压位移为15mm,触发值为5g,测试速率为1Ommso凝胶强度(gmm)计算公式为凝胶强度二凝胶破断强度(g)X凹陷深度(mm)o(6)1.2.6扫描电镜观察将鱼糜样品切成3

11、mm3mm3mm小块，用PBS溶液冲洗3次,每次15min,然后放入体积分数2%的戊二醛液内，4下固定24ho然后分别用体积分数为30%、50%,70%、90%、100%的乙醇溶液进行梯度洗脱，每次IOmin。洗脱后进行冷冻干燥，得到的样品置于干燥皿中保存，最后将样品进行离子溅射仪喷金，扫描电镜观察。2结果与分析2.1 单因素试验2.1.1 酶解温度对SDF提取率的影响从图1可见：随着温度的升高，SDF提取率呈现先上升后下降趋势，在50C时出现最高提取率(18.90%)(/K0.05)；当温度由30上升至50C时，SDF提取率呈显著性提升(火005),SDF提取率从9.8%提高到18.9%,其

12、原因可能是酶在温度影响下空间结构缓慢打开，暴露处有更多的作用基团与底物结合,加快了反应的进行；当温度高于50后，SDF提取率出现显著性下降(火O05),SDF提取率从18.9%下降到15.9%,其原因可能是温度过高,抑制反应酶活力，反应开始变慢。因此，本试验条件下50C为蛋白酶的最适反应温度。标有不同字母者表示组间有显著性差异(火0.05),标有相同字母者表示组间无显著性差异(QO.05),下同。Themeanswithdifferent1ettersaresignificant1ydifferentinthegroupsatthe0.05probabi1ity1eve1,andthemean

13、swiththesame1etterarenotsignificantdifferences,etsequentia.图1不同酶解温度对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.1Effectsofenzymeso1utiontemperatureonSDFextractionrateofIaverPorphyrahaitanensis2.1.2酶添加量对SDF提取率的影响从图2可见：当酶用量小于1.0%时，SDF提取率呈现显著上升趋势，在1.0%时达到最高提取率(18.30%)(/K0.05)；当酶添加量超过1.0%时，SDF提取率无显著性变化(。0.05),其原因可能是随着蛋白酶用量增加后，在酶用量

14、为1.0%时蛋白酶空间结构与底物已经充分接触，达到饱和状态。因此，从经济成本考虑，蛋白酶用量为1.0%时较好。图2不同酶添加量对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.2EffectsofthedosageofenzymeonSDFextractionrateofIaverPorphyrahaitanensis2.1.3酶解时间对SDF提取率的影响从图3可见：随着醐解时间延长，SDF提取率出现显著性上升(火0.05),在60min时达到最高提取率(20.10%)(/K0.05)；60min后提取率趋于平稳(。0.05)。其原因可能是2060min时酶与底物充分接触，反应高效进行，提取率一直处于增长状态

15、，达到60min后，与蛋白酶发生反应的底物可能已反应完毕，所以提取率未明显增加或者减少，处于平稳状态。因此，本试验条件下酶解时间60min为反应最适时间。图3不同酶解时间对坛紫菜SDF提取率的影响Fig.3Effectsofenzymatichydro1ysistimeonSDFextractionrateofIaverPorphyrahaitanensis2.1.4超声功率对SDF提取率的影响从图4可见：当超声功率为270450W时，SDF提取率呈现显著上升的趋势（火0.05）,这可能是超声波破碎了坛紫菜的细胞结构，使得SDF能轻易暴露出来；当超声功率达到450W时，SDF的提取率最高（2181%）（K0.05）;当超声功率超过450W时，提取率处于下降状态，可能是超声的功率过大，破坏了膳食纤维原本的空间结构，形成小分子糖，未被醇沉下来。因此，选取超声功率在450W时效果较好。2.3. 1.5超声时间对SDF提取率的影响从图5可见：随着超声时间的延长，提取率呈先上升后下降的趋势，超声时间为40min时，提取率最高（22.13%）（火0.05）；当超声时间小于40min时，随着超声时间延长，坛紫菜在超声波下被破碎，使得反应进行得更彻底，故提取率处于显著上升趋势（火0.05）；当超声时间大于40min后，提取率出现显著下降趋势（火0.