抗弧菌杀鱼假交替单胞菌2515的潜在毒性及热处理脱毒后抗菌效果.docx

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1、摘要：为评估一株具有弧菌拮抗功能的杀鱼假交替单胞菌2515Pseudoa1teromonaspiscicida2515（以下简称“菌株2515”）对海水养殖动物的毒性，并确定一种有效的热处理脱毒方法，在中国明对虾Fenneropenaeus育苗水体中分别添加浓度为10、10、1010-CFU/m1的菌株2515,测试其对中国明对虾受精卵孵化及幼体发育的影响。结果表明：水体中添加浓度高于IOCFU/m1的菌株2515后，显著降低了无节幼体变态发育至蚤状幼体的成活率（/K0.05）；分别应用血平板及显微观察法测试菌株2515对羊、鱼及对虾血细胞的溶血活性，结果显示，该菌对羊及鱼红细胞均具溶血活性，

2、而对凡纳滨对虾1iIopenaeus侬azzze血细胞无溶血活性；设置不同温度（40、45、50、55、60、65、75）热处理菌株2515及其破碎液，结果显示，551h能够灭活该菌，且失去对鱼类红细胞的溶血活性，而抑菌物质活性可提高55.8%。研究表明，菌株2515对鱼虾具有潜在毒性，选择适当热处理，既能灭活溶血活性还可提高抗菌活性。关键词：中国对虾；杀鱼假交替单胞菌；抗菌活性；加热脱毒弧菌病是海水养殖动物的重要病害之一，给海水鱼、虾和贝类养殖带来了严重危害。目前，针对弧菌病的生物防控，研究人员已发现有多种微生物对弧菌具有拮抗活性，其中，杀鱼假交替单胞菌Pseudoa1teromonaspi

3、scicida是极具开发潜力的一种菌，该菌不仅抗菌谱广，而且还可提高动物的免疫力，将杀鱼假交替单胞菌用于养殖期对虾及贝类也表现出良好的生物安全性。然而也有研究显示，有些杀鱼假交替单胞菌分离株可感染克氏双锯鱼Amphiprionc1arkii卵，导致其存活率较低。乔毅等报道，一株与杀鱼假交替单胞菌同源性较近的菌株对黑媚表现出一定的致病性。细菌毒性来自其含有的内外毒素，内毒素主要为细菌脂多糖，外毒素种类较多，按照作用的靶组织，分为细胞毒素、神经毒素和肠毒素。假交替单胞菌多为海洋菌株，其内毒素毒性通常较低，但研究发现，有些假交替单胞菌可分泌细胞毒素，诱导白血病细胞凋亡或溶血，而有些种类能够分泌神经毒

4、性的河豚毒素，目前对杀鱼假交替单胞菌的毒性研究尚未见报道。本研究中，针对前期筛选出的一株具有广谱弧菌拮抗特性的杀鱼假交替单胞菌，测试了其对中国明对虾FenneropenaeusChinensis受精卵及幼体发育的影响,以及对凡纳滨对虾以Seeusvannamei,鱼及羊血细胞的溶血活性，为去除其潜在毒性，还探讨了热处理对菌株灭活、溶血活性和抗菌物质活性的影响,以期为该菌的开发应用提供技术及方法支撑。1材料与方法1.1 材料试验用中国明对虾受精卵、无节幼体和蚤状幼体由中国水产科学研究院下营增殖实验站提供。杀鱼假交替单胞菌2515（简称菌株2515）、地衣芽泡杆菌Baci11usIiehenifO

5、rmis、对照组假交替单胞菌2905（简称菌株2905）和金黄色葡萄球菌Staphy1ococcusaureus均由农业农村部海水养殖病害防治重点实验室保存。TCBS培养基、羊血平板均购自北京路桥技术股份有限公司。1.2 方法1.2.1 培养基及血平板制备TCBS培养基：配制方法参照说明书。2216E培养基：胰蛋白豚5g、酵母膏1g、FePO1400.01g、琼脂粉16g（固体培养基）、陈海水11,PH7.8,121高压灭菌15mio鱼血平板制备：用无菌注射器抽取大菱鳏尾静脉血液，置入等体积的阿氏液（NaCHO2H01.60g、CHoO.11g、CHQ4.10g、NaC1O.84g、蒸储水20

6、0m1,pH6.1,115C灭菌30min）轻轻摇匀备用。将灭菌后的2216E固体培养基冷却至4050C时，加入10%的鱼血备用液，摇匀后倒平板。1.2.2 菌液制备将菌株2515和地衣芽泡杆菌分别接种于2216E固体平板，于28C下培养活化后再接种到液体培养基中，在28下以150r/min摇床培养24h,菌液经过6OOoXg离心10min,将沉淀用海水稀释成IX1OCFU/m1菌悬液，4C下冷藏带到试验场地，根据试验设计浓度稀释后使用。1.2.3菌株2515对中国明对虾受精卵孵化及幼体发育成活影响试验1）幼体成活试验。试验用对虾育苗袋（直径25CnI,高40CnI）132个，分别加入经过消毒

7、杀菌处理的育苗用海水21作为试验水体。根据幼体发育阶段设置3个试验，分别测试菌株2515对中国明对虾虾受精卵孵化至无节幼体m期(N,)、N,发育至蚤状幼体I期(Z)、蚤状幼体期(Z)发育至糠虾幼体I期(M)成活率的影响，每个试验均设置地衣芽泡杆菌阳性对照组及空白对照组，菌株2515及地衣芽泡杆菌均设置I(K1(K10、10CFU/m14个浓度，每个浓度设3组平行。虾受精卵孵化至M期试验中，每个袋投入中国明对虾受精卵800个；N,至Z期、Z,至M期试验中，每个袋中投入相应期别的幼体40个。在受精卵孵化至N：期、N发育至Z期试验中，试验水体中不添加任何饵料；Z：发育至M期试验中，每袋添加卤虫幼体6

8、00个，经充氧气后打包，放在育苗池中水浴。受精卵孵化期、M发育至Z1期、Z：发育至M1期的温度分别控制在17、20、23,试验用海水pH7.8、盐度30。在各期试验结束后，将试验袋内幼体用网目为125Um的筛绢网过滤到烧杯中逐尾计数，并统计成活率：成活率二试验结束时存活数量/试验初始投放数量X1OO机2)幼体发育观察。中国明对虾受精卵孵化至N期时，从各组随机挑出无节幼体5尾，通过光镜观察幼体体表、附肢和活力情况，评价菌株2515对幼体发育的影响。1.2.4 溶血试验1)血平板溶血观察。刮取菌株2515、金黄色葡萄球菌及菌株2905的2216E平板菌落，分别用PBS制成浓度为10*CFU/m1的

9、菌悬液，各取5u1等距点种在羊血琼脂和鱼血琼脂平板上，每种菌株设3个重复。28恒温培养箱培养48h,观察溶血情况。2）虾细胞溶血显微观察。从凡纳滨对虾帽dRe围心腔抽取血液淋巴与等体积的阿氏液混合作为对虾血细胞悬液,取51对虾血细胞悬液与等体积的菌株2515发酵液（浓度IOCFU1）混合后，滴加在载玻片上，改好盖玻片，置于湿盒中4C条件下计时存放,显微镜下间隔Ih观察1次虾血细胞的溶血情况，并设置生理盐水及大菱鳏血细胞对照组。1.2.5 热处理对菌株2515的灭活效果取发酵24h的菌株2515发酵液,用PBS稀释成10CFUm1,分装到6个无菌的1.5m1离心管中，每管4001,分别置于40、

10、45、50、55、60、65的水浴锅中加热处理1h,空白组常温放置1h,之后从每管取100U1涂布于2216E平板。每个样品设3个平行，28下培养，观察有无菌落形成，统计菌落数量。1.2.6 热处理后菌株2515的溶血活性取“1.2.5节”中经40和55C不同时间热处理后的菌株2515处理液，按照1.2.4节中血平板溶血观察方法，点种在鱼血与羊血平板上，观察处理液的溶血活性。1.2.7 热处理对菌株2515抑菌活性的影响取菌株2515发酵液（浓度3.9X10”CFUm1）110m1,以500OXg离心IOmir1,弃上清，将沉淀用PBS洗涤2次后，加50m1PBS重悬，用超声波细胞破碎仪超声破

11、碎10min（300W）,至菌液澄清。将澄清的菌液经0.22Un1孔径的细菌过滤器过滤，之后置于平皿中-20C下真空干燥12ho再用20m1PBS将干燥后的产物洗脱混匀，之后分装到无菌1.5In1离心管中（每管0.2m1）,分别在40、45、50、55、60、65、75水浴锅中进行温浴处理，每个温度设置15、30、45、60min4个处理时间段，对照组常温放置，每组设3个平行。完成热处理后参照李萍等的方法进行抑菌活性测定，测试用2216E平板含有鳗弧菌Vibrioangui11arum浓段为10CFUZm1,经28C培养24h后，用游标卡尺十字交叉法测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小计算菌株2

12、515抗菌活性物质的抑菌活性增长率，即抑菌活性增长率=(-加/X100%o其中,、分别为试验组和对照组抑菌圈直径。1.3数据处理试验结果以平均值土标准差(meanS.D.)表示。采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05o2结果与分析2.1菌株2515对中国明对虾幼体发育的影响从图1可见：相同浓度组中，添加菌株2515与添加地衣芽泡杆菌阳性对照组无节幼体的成活率均无显著性差异(/0.05)；在所有试验组中,添加浓度为10CFU/m12515菌株的幼体成活率最高，显著高于添加浓度为I(K1oCFU/m1的地衣芽泡杆菌组(人0.05),也

13、显著高于添加浓度IO1、10-CFUZm1的菌株2515组(火0.05)；空白对照组与各浓度组均无显著性差异(00.05)。显微观察各组无节幼体的外形特征，可见各试验组无节幼体活力较好，体表干净，附肢发育正常，未出现弯曲现象。这表明，所选择的浓度范围内,菌株2515对中国明对虾受精卵孵化至N,期的成活率无明显影响。标有不同字母者表示组间有显著性差异(K0.05),标有相同字母者表示组间无显著性差异(处0.05),下同。Note:Themeanswithdifferent1ettersaresignificant1ydifferentinthegroupsatthe0.05probabiIity

14、1eve1,andthemeanswiththesame1etterarenotsignificantdifferences,etsequentia.图1卵孵化至N，期的成活率Fig.1Surviva1rateof1arvaefromeggtonaup1iusIII(N)从图2可见：各浓度组对虾的成活率差别较大，相同浓度组中，添加菌株2515与添加地衣芽抱杆菌阳性对照组的成活率中仅浓度为IOCFU/m1的组与空白对照组无显著性差异(00.05),其他组均显著低于空白对照组(火0.05),而添加浓度为10、1。CFU/m1的两组中，添加2515菌株的对虾成活率显著低于添加地衣芽抱杆菌组(AO.0

15、5)；在所有添加菌株2515的组中，随着添加浓度的升高对虾的存活率呈降低趋势。这表明，在本试验条件下，菌株2515浓度高于10CFU/m1时对中国明对虾由N期发育至Z,期有显著性影响，可显著降低无节幼体变态发育至蚤状幼体的成活率。图2N到Z期变态成活率Fig.2Metamorphosissurviva1rateof1arvaefromN，tozoeaI(Z)从图3可见，各试验组与添加地衣芽抱菌组及空白对照组的对虾成活率均无显著性差异(处0.05)o图3到M期变态成活率Fig.3Metamorphosissurviva1rateof1arvaefromZ:tomysisI(M)2.2菌株2515

16、的溶血性从图4可见，菌株2515在两种血平板上均具有溶血活性，阳性对照组金黄色葡萄球菌在羊血平板上产生溶血,对照组假交替单胞菌株2905在羊血平板上未产生溶血，而在鱼血平板上产生溶血。Fig.4Hemo1ysiseffectofstrain2515onsheepandfishb1ood大菱鳏血细胞试验组，在加入菌株25153h后，红细胞出现细胞膜溶解（图5C）,胞内物质固缩变形,有些趋于解体，白细胞则不发生溶血，而大菱鳏生理盐水对照组放置18h后（图5B）,白细胞及红细胞的形态仍然完整;对虾血细胞试验组（图5G）与对虾生理盐水对照组（图5F）中，在加入菌株2515及生理盐水18h时，两组对虾血细胞形态相似，细胞的形态均趋于收缩变圆，但外形完整，