氨基酸对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响.docx

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1、摘要:为研究氨基酸对铜绿微囊藻Microcystisaeruginosa生长及叶绿素荧光参数的影响，设定藻的初始密度为2X10ce11s/m1,以6种氨基酸(天门冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸)为唯一氮源，分析在实验室模拟自然水体不同氨基酸浓度(12、25、50、75、100RmOI/1)条件下，铜绿微囊藻细胞数量、叶绿素a含量及相关叶绿素荧光参数(/ETR)的动态变化。结果表明：无氮对照组的藻细胞数量、叶绿素a含量及相关叶绿素荧光参数均显著低于各氨基酸试验组(A0.05)；随着氨基酸浓度的升高，6种氨基酸均能促进铜绿微囊藻的生长及相关叶绿素荧光参数的提高，且多种氨基酸在浓度为

2、100Umo1/1时达到最高值；随着培养时间的延长，除谷氨酸试验组各项指标波动明显外，其余各氨基酸试验组的藻细胞数量、叶绿素a含量及相关叶绿素荧光参数总体上均呈先上升后下降趋势，其结果基本符合藻细胞延滞期、对数生长期、稳定期的规律。研究表明，不同浓度和不同种类的氨基酸对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数提高均表现出有利特征,且氨基酸的作用程度依次为天门冬氨酸丝氨酸精氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸，本研究结果可为揭示自然水体中氨基酸对铜绿微囊藻的影响机制提供数据参考。关键词：铜绿微囊藻；氨基酸；细胞密度；叶绿素荧光参数目前，蓝藻水华问题日趋突出，其暴发时不仅对水质产生严重影响,且有些蓝藻种类可产生一系列毒性

3、较强的次级代谢产物，对水生动物及人类健康造成潜在或直接的危害。中国水华蓝藻共有26种，其中微囊藻属板CroCySSS和鱼腥藻属十分常见，随着富营养化水平的加剧，淡水养殖水体水华优势种逐渐演变为微囊藻属一类，且发生面积及频率呈逐年上升趋势。万蕾等研究表明，铜绿微囊藻是引起淡水水华的主要优势种。温度、光照等物理因素通常被认为是水华季节演替的原因，但水华的频繁暴发主要还是归因于水体中氮负荷的加剧所造成的水体富营养化。氮是维持藻类生长所必需的营养因子，其在自然水体中的含量、形态构成对藻类的生长有着重要影响。自然水体中的氮源除以无机氮（如氨氮NH：N、硝态氮NO,-N、亚硝态氮NON等）形式存在外，还能

4、以有机氮（如尿素、蛋白质、多肽和游离氨基酸等）形式存在。目前，有关无机氮对铜绿微囊藻板CToCPSSaerugOSd生长和产毒影响已有大量研究。张青田等认为，低浓度氨氮（0.5mmo11）适宜铜绿微囊藻生长，浓度升高则会抑制其生长；唐全民等进一步研究发现，当氨氮浓度较低时，铜绿微囊藻虽然可较快吸收利用氨氮，但藻细胞却处于氮缺乏状态使生长减慢，当氨氮浓度较高时，不利于藻细胞的生长；吴轩浩等研究表明，低浓度氨氮促进铜绿微囊藻生长繁殖和产毒含量，而高浓度氨氮对于铜绿微囊藻生长和产毒具有一定的抑制作用；周涛等研究发现，相同浓度下，铜绿微囊藻对硝态氮的利用程度低于氨氮，且硝态氮对其生长繁殖和光合作用的能

5、力也低于氨氮。目前，关于有机氮对藻类生长影响的相关研究较少，且多是对尿素氮相关研究的报道。如黄文敏等研究表明，铜绿微囊藻能有效吸收利用尿素作为氮源，且高浓度的尿素氮促进其生长。但也有研究发现，有些藻类不能利用尿素氮生长，如Yamaguchi等研究发现，卵圆卡盾藻Chattone11a。3为不能利用尿素形态的有机氮,推测其原因可能与该藻细胞内缺少尿素酶有关。而氨基酸作为有机氮的主要存在形式，在水体氮循环中扮演着重要角色，但其在淡水生态系统中的浓度分布有较大差异，如日本琵琶湖氨基酸浓度为4.07.2umo1/1,美国佐治亚洲Satina河水为59.0mo1/1,而在以铜绿微囊藻为优势种的太湖中，氨

6、基酸浓度在春季为40.960.4mo1/1,秋季为75.3893.96Umo1/1。近年来，关于氨基酸方面的研究多为其在自然水体中的释放机制，而通过人为控制其种类和浓度对铜绿微囊藻的研究鲜有报道，如吴轩浩等研究了不同浓度下丙氨酸对铜绿微囊藻生长和产毒的影响，Dai等研究了单一高浓度下6种氨基酸对铜绿微囊藻生长和产毒的影响。这些前期相关研究中，一方面缺乏对自然水体中氨基酸浓度范围的合理选择，另一方面缺乏其对铜绿微囊藻生长产生影响时，叶绿素a含量和相关叶绿素荧光参数的变化情况。本研究中，通过铜绿微囊藻的分子结构和氨基酸侧链基团极性进行划分，选择了天门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Ar

7、g)、谷氨酸(G1u)丙氨酸(A1a)和甘氨酸(G1y)等6种不同种类的氨基酸,以自然水体中氨基酸浓度范围为界，研究其作为培养基中的唯一添加氮源时,与无氮培养基(不添加氮源)为空白对照时对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响，以期为控制自然水体中蓝藻水华暴发的机制提供数据参考。1材料与方法1.1 材料试验用藻种铜绿微囊探(FACHB-905)购自中国科学院水生生物研究所。在BGI1培养基中进行培养，培养温度为(301)C,光照强度为2000Ix,光暗周期为121：12Do试验所用藻种在接种之前需进行预处理，在其生长至对数期时，取适量藻种离心浓缩，用无菌蒸储水洗涤23次后接种于无氮培养基BGI1

8、中先饥饿培养3d,使得藻细胞内氮气被消耗殆尽。1.2 方法1.2.1 试验设计将经过饥饿培养后的铜绿微囊藻分别接种到以天门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser).精氨酸(Arg).谷氨酸(G1u),丙氨酸(A1a)甘氨酸(G1y)作为唯一添加氮源的培养基中，以无氮培养基作为空白对照，研究6种氨基酸分别在12、25、50、75、100mo115个浓度(各氨基酸浓度以氮元素的质量浓度为准)下对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响。各组培养基初始体积均为200m1,初始接种藻密度约为210ce11s/m1,试验期间，每天摇动藻液，以防止藻细胞贴壁下沉。试验周期为16d,每组设3个平行，每隔2d测定藻细胞

9、数量、叶绿素荧光参数等相关指标，并对以上指标进行处理分析，以探明不同种类、不同浓度的氨基酸对铜绿微囊藻生长及叶绿素荧光参数的影响。1.2.2 指标测定与计算1)藻密度。取少量混合均匀的藻液，在显微镜下用血球计数板对藻细胞数量计数两次。若两次相差超过20%,则需进行第3次计数。2)叶绿素荧光参数。利用浮游植物荧光仪(PHYTO-PAM)测定铜绿微囊藻藻液中叶绿素a(Ch1-a)含量、叶绿素荧光基础参数及光反应中心PSn光合电子的传递速率(e1ectrontransferrate,ETR),具体测定参见刘忠荣、游波等的方法。根据检测所得叶绿素荧光基础参数(八F)计算可得到光反应中心PSII的最大量

10、子产量(即最大光能转化效率,/),其计算公式为/二(-F)/凡其中：为初始荧光值(minima1f1uorescence)；为最大荧光值(maxima1f1uorescence)o1. 3数据处理试验结果以平均值土标准差(meanS.D.)表示，采用SPSS20.0软件对试验数据进行方差分析，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05o2结果与分析1.1 铜绿微囊藻的生长变化控制对照组和各试验组的初始接种藻细胞数量为2X10ce11s/m1o从图1可见：在试验期间，对照组的藻细胞数量在第26天时略有上升，但始终低于各氨基酸试验组，约为各氨基酸试验组最低浓度时平均藻细胞数量的2/

11、3；各氨基酸试验组藻细胞数量在不同浓度下存在显著性差异（K005）o随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组平均藻细胞数量发生明显的变化，其中，谷氨酸试验组平均藻细胞数量呈先上升后下降的趋势，在氨基酸浓度为75UmOI/1时达到峰值3.78X10ce11s/m1；除谷氨酸试验组外，其他5种氨基酸试验组平均藻细胞数量均呈上升趋势，在氨基酸浓度为100mo1/1时均达到最高值（图1）。1.2 随着培养时间的延长，除谷氨酸试验组藻细胞数量波动较明显以外,其他5种氨基酸试验组藻细胞生长整体均呈先上升后下降趋势，除丙氨酸试验组藻细胞数量于第4天时出现最大值外，其他5种氨基酸试验组藻细胞数量最大值均出现在第8

12、天（图Do1.3 氨基酸对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响从表1可见：各氨基酸试验组不同浓度下Ch1-a含量均存在明显差异，随着氨基酸浓度的升高，各氨基酸试验组平均Ch1-a含量总体上呈上升趋势；天门冬氨酸浓度为IOOUmOI/1时，分别在第2、4、10、12、14、16天时达到最高值，丝氨酸浓度为100UmOI/1时各培养时间下均达到最高值，精氨酸浓度为100UmoI/1时，除第2天外，其余各时间点均达到最大值，谷氨酸浓度为100umo1/1时，分别在第8、10、12、14天时达到最大值。随着试验的进行，对照组的Ch1-a含量总体呈下降趋势；除谷氨酸试验组波动较明显以外，其他5种氨基酸试验组在不

13、同浓度下的Ch1-a含量随着培养时间的延长，总体上均呈先上升后下降的趋势，ChI-a含量最大值均出现在培养的第8天；各氨基酸试验组Ch1-a含量变化情况总体上为天门冬氨酸试验组中的ChI-a含量最高，其次为丝氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中，甘氨酸试验组的Chba含量最低，且高浓度（50、75、100HmOI/1）试验组中的Ch1-a含量明显高于低浓度（12、25Hmo1/1）试验组（表1）。表1氨基酸对铜绿微囊藻Ch1-a含量的影响Tab.1EffectsofaminoacidsonCh1-acontentofb1uegreena1gaMicrocystisaeruginosaam

14、inoadd该度,(VmO1!.)concentrntimCh1a含量Ch1orophy11acontent,(jg11)Od2d4d6dKdIOd12dI1d16d0112.663.8794.29260M670.7177.651.3651.912.2342.540.9338.29I.432X42I.7627.990.8312136.285.95151.915.56161.395.59165.06.28185.913.11K7.O64.37115.560-8$101.05.5682.O11.66天门25137.753.H19.50.80188.69346232.416.18307.872782

15、87.195.17306451162288.722.44263.129.68冬氮触50133.633.21208.57.97211.01361U8.08.8446.251.57120.196.07327.162.7272.25.17224.15+10.66AXP75131.53632181.573.83260.01.59388.698.9147O.OO15.O1IOi.715.53306252M274.12272252.16.72100131.545.32196.273.51317.162.32345.1O7.31460.177.87433.6711.48452.857.39333.8116.263.2114.6*12133.9O4.72137.666.02103.365.90102.064.6278.805.2670.o.O166.386.0468,1230856,27375Scr25137.193.47123.509.51132.125