血中碳氧血红蛋白的分光光度法.docx

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1、血中碳氧血红蛋白的分光光度法1 .适用范围：血中碳氧血红蛋白的定量测定。2 .原理：血液中含有四种血红蛋白成分，即还原血红蛋白（Hb）,氧合血红蛋白（HbO2）、碳氧血红蛋白HbCO及微量的变性血红蛋白HbMeto用连二亚硫酸钠将Hb02和HbMet还原成Hb,则血液中只存在HbCO和Hb两种成分。HbCO和HVB的最大吸收波长分别在42Onm和430nm测出被检血样在两个波长下的吸光度，在利用HbCO与Hb两个波长下的摩尔吸光系数计算HbCO的百分浓度。3 .方法重要参数3. 1线性范围：测定范围为2%-70%HbC0;3.2 精密度：相对标准偏差为1.9%-5.6%（HbCO浓度为9.9%

2、,36.6%,56.8%,n=6）o3.3 准确度：血样加已知浓度血测定回收率为95.8%（3个浓度，n=8）o检出限：本法的最低检测浓度为2%HbC0（按取101血样计）。3.5全程测定时间：60mino4.器材与试剂4.1器材4.1.1采血吸管。4.1.2小玻璃管，25mmX4,带帽。4.13试管,IOm1,具有口塞,实际能盛15m1至满。4.1.4液体快速混合器。4.15分光光度计。4.2试剂实验用水为蒸锵水。4.2.1硫酸o1.1.1 2.2甲酸,85%(mm)o4.2.3 连二亚硫酸钠(Na2S204)o4.2.4 氮气，高纯。4.2.5 2.5氧气，高纯。4.2.6 一氧化碳纯气，

3、钢瓶装或自制。制备方法：在装有滴液漏斗和气体导出管的烧瓶中加入甲酸，然后缓慢滴入浓硫酸，产生的CO通过氢氧化钠洗气瓶及另一空瓶后，通入样品液中。操作应在良好的通风橱内进行。4.2.7 氢氧化钠溶液,20g1o4.2.8血液稀释液,0.02mo11三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液。4.2.9肝素溶液,5g1o5 .操作步骤5.1 摩吸光系数的测定：摩尔吸光系数不易测定，但在本法计算中，可用同一浓度的血样制得Hb及HbC0,测其在42Onn1及43Onm下的吸光值来代替，作为常数。测定方法如下：取不吸烟健康人血（肝素抗凝）,用水稀释5倍。取0.31加血稀释液至90m1,通氧气30min0从中取4份

4、，每份15m1于试管中，其中2份通氮气IOmin,以除于过剩的氧，得到HbO2液。另两份同纯一氧化碳气IOnIin,得到HbCO液。立即将HbO2、HbCO制备液分别转入内盛60mg连二亚硫酸钠的试管中，混匀，放置IOnIin后测量。读取43OnnI和42Onm波长处的吸光值，代替摩尔吸光系数（以下简称吸光常数）。5.2 样品处理和测定：将冷藏的血样于室温放置，用液体快速混合器混匀。迅速取101（二个平行样），加入内盛15m1血液稀释液的试管中（若采样后随即分析，可直接取101血放入内盛15m1血液稀释液的试管中），加入60mg连二亚硫酸钠，轻轻混匀，放置IOrnino用IOmnI比色杯，以试

5、剂空白为参比，测其在420nm和43Onn1波长处的吸光度。6 .计算按式（9-39）计算血中HbCo的浓度：C=仪30*：2-42。*匕A202-）4301）式中：C血中HbCO的浓度，%；A420血样在42Onm波长处的吸光度读数；A430血样在43OnnI波长处的吸光度读数据；k1HbCo在42Onm波长处的吸光常数；k2HbCO在430nm波长处的吸光常数；k3Hb在430nm波长处的吸光系数7 .说明7.1本法测定所依据的Hb与HbCO含量比例与血红蛋白含量高低无关，因此取血量不需要很准确。吸光度常数测定后只要仪器波长稳定，可较长时间的使用。7.2空气中有大量氧气，所以血样及制成的待

6、测液接触空气越少越好。实验证明含HbCO20%及近饱和的Hbeo待测液,其容器上端空气分别为5m1-6m1及20m1时，较装满或近满者,测定结果HbCo平均下降4.5%及10.2%(n=6)o7.3非高纯级的钢瓶氧气和氮气含有微量的一氧化碳。制备Hb02时应通过加热至80oC-100oC的1cm*10cm霍加拉特管除去。7.4连二亚硫酸钠遇水易分解，应避光密封保存，临用现称。如试剂放置过久可按下法标定：用预先盛有15m1250g1碱性溶液的30m1高型称量瓶,称取约Ig样品(称量至0.002g)。待样品充分溶解后移于25Om1容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，明吸出25.Om1置于锥形瓶中。加5d5%(vv)乙酸溶液，2m110g1可溶性淀粉溶液，用0.05mo11碘标准溶液滴定至蓝色为终点。计算连二亚硫酸钠的百分含量。7.5本法摘自上海市化工局企业标准：沪QHG2-001-80(88)o