2015年版《中国药典》通则0722 维生素D测定法通则.docx

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1、0722维生素D测定法本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定维生素D（包括维生素Dz和维生素Dr下同）及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D0.025ug。测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。第一法对照品贮备溶液的制备根据各制剂中所含维生素D的成分，精密称取相应的维生素Dz或D3对照品25mg,置IOomI棕色量瓶中，加异辛烷80m1,避免加热，超

2、声处理1分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，作为贮备溶液（1）;精密量取5m1,置50m1棕色量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，Oc以下保存，作为贮备溶液（2）O测定维生素D?时，应另取维生素Ds对照品25mg,同法制成维生素D3对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。色谱条件与系统适用性试验用硅胶为填充剂；以正己烷-正戊醇（997：3）为流动相；检测波长为254nm.量取维生素D对照品贮备溶液（1）5m1,置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，加正己烷5m1,摇匀，置ICm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光

3、灯下，将石英吸收池斜放成45并距灯管56cm,照射5分钟，使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素Ds和速密醇Dr量取该溶液注入液相色谱仪，进样5次，记录峰面积，维生素Ds峰的相对标准偏差应不大于2.0%；前维生素D：,峰（与维生素D：；相对保留时间约为0.5）与反式维生素d峰（与维生素D?相对保留时间约为0.6）以及维生素D3峰与速备醇D3峰（与维生素Da相对保留时间约为1.1）的分离度均应大于1.Oo校正因子测定精密量取对照品贮备溶液（2）5m1,置50m1量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取Io1a注入液相色谱仪，记录色谱图，计算维生素D的校正因子f1。f=c/A

4、1式中C1为维生素D对照品溶液的浓度，gm1;A1为对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积。另精密量取对照品贮备溶液（2）5m1,置50In1量瓶中，加2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90C水浴中加热15小时，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取IOU1注入液相色谱仪，记录色谱图，计算前维生素D的校正因子f20f=（-1A1）A2式中C1为f1测定项下维生素D对照品溶液的浓度，gm16为维生素D的校正因子；A1为混合对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积；A2为混合对照品溶液色谱图中前维生素D峰的峰面积。测定法取该制剂项下制备的供试品溶液进行测定

5、，按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量（ci）oCiH/1Ai1+fAa式中AH为维生素D峰的峰面积；A2为前维生素D峰的峰面积。第二法供试品溶液A的制备精密称取供试品适量（相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g）,置皂化瓶中，加乙静30m1、维生素CO.2g与50%氢氧化钾溶液3m1若供试量为3g,则加50%氢氧化钾溶液4d,置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水IOm1冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60IOOm1分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醛振摇提取3次，第一次60m,以后每次40m,合并乙醛液，用水洗涤

6、数次，每次约IOonII,洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚献指示液不再显红色，静置，分取乙醛提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙酸提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙酸洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5m1,再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3m1,密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。净化用色谱系统分离收集维生素D精密量取上述供试品溶液A5001,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇-乙懵-水（50：50：2）为流动相进行分离，检测波长254nm,记录色谱图，维生素D与前维生素D应为重叠峰，并能与维

7、生素A及其他杂质分开。准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，精密加入正己烷溶液适量，使每Im1中含维生素D50140单位，密塞,超声处理使溶解，即得供试品溶液测定法取供试品溶液B,照第一法进行含量测定，进样量为10020010。第三法供试品溶液的制备取该制剂项下制备的供试品溶液A,按上述第二法净化用色谱系统分离维生索D项下的方法处理，至“用氮气流迅速吹干”后，加入异辛烷2m1溶解，通氮排除空气后，密塞，置90水浴中，加热1.5小时后，立即通氮在2分钟内吹干，迅速精密加入正己烷2m1,溶解后，即得供试品溶液C。对照品溶液的制备精密量取对照品贮备溶液（1）适量，加异辛烷定量稀释制成每In11中约含维生素D50单位，精密量取2m1,置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶液制备项下的方法,自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。测定法照第一法项下的色谱条件，精密量取对照品溶液与供试品溶液C各200口1,注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算维生素D的含量。