2015年版《中国药典》通则0541 电泳法通则.docx

《2015年版《中国药典》通则0541 电泳法通则.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2015年版《中国药典》通则0541 电泳法通则.docx（10页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、0541电泳法电泳是指溶解或悬浮于电解液中的带电荷的蛋白质、胶体、大分子或其他粒子，在电流作用下向其自身所带电荷相反的电极方向迁移。电泳法是指利用溶液中带有不同量电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中使供试品组分以不同的迁移速度向对应的电极移动，实现分离并通过适宜的检测方法记录或计算，达到测定目的的分析方法。电泳法一般可分为两大类：一类为自由溶液电泳或移动界面电泳，另一类为区带电泳。移动界面电泳是指不含支持物的电泳，溶质在自由溶液中泳动，故也称自由溶液电泳，适用于高分子的检测。区带电泳是指含有支持介质的电泳，带电荷的供试品（如蛋白质、核甘酸等大分子或其他粒子）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂

2、糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，在电场的作用下，向其极性相反的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带。区带电泳法可选用不同的支持介质，并用适宜的检测方法记录供试品组分电泳区带图谱，以计算其含量（）。除另有规定外，各不同支持介质的区带电泳法，照下述方法操作。采用全自动电泳仪操作时，参考仪器使用说明书进行；采用预制胶的电泳时，参考各电泳仪标准操作规程进行；结果判断采用自动扫描仪或凝胶成像仪时，参考仪器使用说明书进行。第一法纸电泳法纸电泳法以色谱滤纸作为支持介质。介质孔径大，没有分子筛效应，主要凭借被分离物中各组分所带电荷量的差异进行分离，适用于检测核甘酸等性质相似的物质。1仪器装置包括

3、电泳室及直流电源两部分。常用的水平式电泳富装置如图,包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃（或相应材料）盖B；两侧的电泳槽均用有机玻璃（或相应材料）板C分成两剖分；外格装有粕电极（直径0.50.8CnI）D；里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F,此架可从槽中取出；两侧电泳槽A内的钳电极D经隔离导线穿过槽壁与电泳仪外接电源相连。的水平式电泳空装置电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在100500V,高压电泳一般在500IOOOOVo2.测定法（1）电泳缓冲液枸椽酸盐缓冲液（pH3.0）：取枸椽酸（CcH8O7-H2O）39.04g与枸椽酸钠（CeH5Na3O72H0）4.12g,加水400Om

4、1使溶解。(2)滤纸取色谱施纸置1mo11甲酸溶液中浸泡不少于12小时，取出，用水漂洗至洗液的PH值不低于4,置60烘箱烘干，备用。可裁成长27cm、宽18CIn的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距底边58cm处划一起始线，每隔2.53cm做一点样记号。(3)点样有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸椽酸盐缓冲液(pH3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近负极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点101,共3点，并留2个空白位置。干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后

5、将电泳缓冲液用喷雾器喷湿滤纸，点样处最后喷湿，本法适用于浓度低的供试品溶液。(4)电泳于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没伯电极，接通电泳仪稳压电源，电压梯度调整为1820Vcm,电泳约1小时45分钟，取出，立即吹干，置紫外光灯(254nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。(5)含量测定剪下供试品斑点以及与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.0Imo1/1盐酸溶液5m1,摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各品种项下的规定测定滤液或上清液的吸光度，并计算含量。第二法醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法以醋酸纤维素薄膜作

6、为支持介质。介质孔径大,没有分子筛效应,主要凭借被分离物中各组分所带电荷量的差异进行分离，适用于血清蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、类固醇激素及同工酶等的检测。1 .仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳。2 .试剂(1)巴比妥缓冲液(pH8.6)取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g,加水溶解使成IOOOm1。(2)染色液常用的有以下几种，可根据需要，按各品种项下要求使用。氨基黑染色液取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50m1、冰醋酸IOm1及水40m1的混合液中。丽春红染色液取丽春红9.04g、三氯醋酸6g,用水溶解并稀释至IOOm1。含有醋酸的丽春红染色液取丽春红0.1g,醋酸5m1用水制

7、成IOOm1的溶液。4保存。含有三氯醋酸和5-磺基水杨酸的丽春红染色液取丽春红2g,三氯醋酸30g,5-磺基水杨酸30g,用水溶解并稀释至IoOn1。(3)脱色液取乙醇45m1、冰醋酸5m1及水50m1,混匀。(4)透明液取冰醋酸25m1加无水乙醇75m1,混匀。3 .测定法(1)醋酸纤维素薄膜取醋酸纤维素薄膜，裁成2cmX8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上，置电泳槽架上，经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(PH8.6)中。（2）点样与电泳于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白质含量约5%的供试品溶液23

8、u1,一般应在1012Vcm稳压或0.40.6mAcm总电流量=电流量（mA/cm）X每条膜的宽度（cm）X膜条数稳流条件下电泳至区带距离45cm为宜（执行中国药典三部的生物制品一般采用稳流条件）。人血白蛋白与免疫球蛋白类样品，在测定时取新鲜人血清作对照，电泳时间以白蛋白与免疫球蛋白之间的电泳展开距离约2cm为宜。（3）染色电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑或丽春红染色液中，23分钟后，用脱色液浸洗数次，直至脱去底色为止。（4）透明将洗净并完全干燥后的膜条浸于透明液中，一般浸泡1015分钟，待全部浸透后，取出平铺于洁净的玻璃板上，干后即成透明薄膜，可用于相对含量、纯度测定和作标本长期保存。（5）含

9、量测定未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各品种项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对含量（）。洗脱法将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全，照紫外-可见分光光度法（通则（MO1）,在各品种项下规定的检测波长处测定洗脱液的吸光度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白质部位，同法操作作为空白对照。先计算吸光度总和，再计算各蛋白质组分所占比率（）。扫描法将干燥的醋酸纤维素薄膜用薄层色谱扫描仪采用反射（未透明薄膜）或透射（己透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白质组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐

10、标为吸光度，计算各蛋白质组分的含量（）。亦可用微机处理积分计算。人血白蛋白与免疫球蛋白类样品，以人血清作为对照，按峰面积计算各蛋白质组分的含量（）.第三法琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法以琼脂糖作为支持介质。琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3,6-脱水-1-半乳糖。许多琼脂糖链互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型的凝胶。这种网络结构具有分子筛作用，使带电颗粒的分禽不仅依赖净电荷的性质和数量，还可凭借分子大小进一步分离，从而提高了分辨能力。本法适用于免疫复合物、核酸与核蛋白等的分离、鉴定与纯化。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电

11、点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA直线DNA开环双链DNA。适用于检测DNA,PCR反应中的电泳检测，方法见各品种项下。方法11仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳。4 .试剂(1)醋酸一锂盐缓冲液(pH3.0)取冰醋酸50m1加水80Om1混合后，加氢氧化锂固体适量使溶解调节PH值至3.0,再加水至IOOOm1o(2)甲苯胺蓝溶液取甲苯胺蓝0.1g,加

12、水IOOnII使溶解。5 .测定法(1)制胶取琼脂糖约0.2g,加水IOrn1,置水浴中加热使溶胀完全，加温热的醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0)IOm1混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5CInX7.5C1n或4cmX9cm)的水平玻璃板上，涂层厚度约3mm,静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。(2)对照品溶液及供试品溶液的制备照各品种项下规定配制。(3)点样与电泳在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥与缓冲液接触。于凝胶板负极端分别点样Iu1,立即接通电源，在电压梯度约30Vc电流强度12mACm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。(4)染色与脱色

13、取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。方法21 .仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳。2 .试剂(1)巴比妥缓冲液(pH8.6)称取巴比妥4.14g、巴比妥钠23.18g,加水适量，加热使之溶解，放冷至室温，再加叠氮钠015g,溶解后，加水稀释至1500m1。(2) 1.5%琼脂糖溶液称取琼脂糖1.5g,加水50m1和巴比妥缓冲液(pH8.6)50m1,加热使完全溶胀。(3) 0.5%氨基黑溶液称取氨基黑IoBo.5g,溶于甲醇50m1、冰醋酸IOmI及水40m1的混合液中。(4)脱色液量取乙醇45m1、冰醋酸5m1及水50m1,混匀。(5)澳酚蓝指示液称取溟酚蓝5

14、0mg,加水使之溶解，并稀释至IOOn11。3.测定法(1)制胶取上述1.5%的琼脂糖溶液，趁热将胶液涂布于大小适宜的水平玻璃板上，涂层厚度约3mm,静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层，即得。(2)对照品和供试品溶液对照品正常人血清或其他适宜的对照品。供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品稀释成蛋白质浓度为1%2%的溶液。(3)点样与电泳在电泳槽内加入巴比妥缓冲液(pH8.6)：于琼脂糖凝胶板负极端的1/3处打孔，孔径23mm,置于电泳槽架上，经3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液(pH8.6)接触。测定孔加适量供试品溶液和1滴浪酚蓝指示液，对照孔加适量对照品及1滴浪酚蓝指示液。IoOV恒压条件下电泳

15、2小时(指示剂迁移到前沿)，关闭电源。(4)染色与脱色取下凝胶板，用0.5%氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景无色。第四法聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。单体的浓度或单体与交联剂比例的不同，其凝胶孔径就不同。使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行电泳，生物大分子保持天然状态，其迁移速率不仅取决于电荷密度，还取决于分子大小和形状，可以用来研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、等电点等。根据仪器装置的不同分为水平平板电泳、垂直平板电泳和盘状电泳。根据制胶方式的不同又可分为连续电泳和不连续电泳。1仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘电泳槽或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽，每个槽中都有固定的伯电极，钳电极经隔离电线接于电泳仪稳流档上。使用垂直平板电泳槽的测定法参见SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，使用圆盘电泳槽方法如下。2 .试剂(1)溶液A取三羟甲基氨基甲烷36.6g、四甲基乙二胺0.23In1加Imo1/1盐酸溶液48m1,再加水溶解并稀释至IOOn11,置棕色瓶内，在冰箱中保存。(2)溶液B取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀释至100m1,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。(3)电极缓冲液(pH8.3)取三羟甲基氨基甲