检验用菌种管理制度.docx

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1、检验用菌种管理制度编制人/日期:审核人/日期:批准人/日期:检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第2页共11页修订页修订次条款号修订内容修订人日期检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第3页共11页目录1 .目的42 .适用范围43 .职责44 .程序45 .相关文件I16 .记录表样11检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第4页共11页1 .目的规范公司微生物实验使用的检验用菌种的管理。2 .适用范围适用于检验用菌种的管理，包括菌种的采购，保存，传代，使用及销毁。3 .职责检验员负责本制度的执行。质管部负责人对检验员的实际执行情况进行

2、监督。4 .程序4.1 菌种的定义4.1.1 标准菌种指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌；4.1.2 传代用菌种指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种；4.1.3 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面、半固体培养基培养后，作为日常工作使用的菌种。工作用菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌种为第O代）；4.1.4 本文中检定菌种包括传代用菌种和工作用菌种。4.2 菌种的采购和验收4.2.1 微生物检测人员根据菌种的使用情况，提出年度购买计划，交质管部经理审批；4.2.2 向中检所

3、菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数；4.2.3 菌种到达实验室后，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在检定菌种接收记录，并将其暂贮存于2-8C冰箱中，在一周内必须完成转种。4.3 菌种的保存4.3.1 斜面低温保存法操作方法：将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第5页共11页至2-8冰箱中；4.3.2 半固体石蜡低温保存法操作方法：将菌种穿刺接种到硫乙醉酸盐流体培养基中，待菌生长充分以后，经培养箱培养后取出，用无菌

4、液体石蜡滴加到半固体琼脂菌种管表层约0.5Cm高度,转移至2-8冰箱中；4.3.3 甘油冷冻管保存法操作方法：4.3.3.1 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的0.9%无菌生理盐水；4.332调整菌液浓度，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌含20%甘油的0.9%无菌生理盐水，即为10%甘油菌悬液；433.3轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，转移至-20C冷冻条件下；434各菌种的保存方法、条件及期限，见下表】表1传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限保存方法菌种名称保存期限保存温度

5、斜面低温保存法大肠埃希菌(CMCC(B)44102)1个月2-8金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)1个月铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)1个月枯草芽抱杆菌(CMCC(B)63501)3个月白色念珠菌(CMCC(F)98001)2个月黑曲霉菌(CMCC(F)98003)3个月半固体石蜡低温保在注生泡梭菌(CMCC(B)64941)1个月2-8甘油冷冻管大肠埃希菌(CMCC(B)44102)2年-20金黄色菊萄球菌(CMCC(B)26003)铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)枯草芽花杆菌(CMCC(B)63501)生胞梭菌(CMCC(B)64941)白色念珠菌(CMCC(F)

6、98001)黑曲霉菌(CMCC(F)98003)4.4标准菌种的复苏和确认4.4.1标准菌种的复苏检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第6页共11页441.1在生物安全柜内用75%的酒精擦拭冻干菌种管（安甑）的外表面并让其自然风干。用一小砂轮在安甑的上部划一条线，用手轻轻将安瓶掰开（开启安能时必须小心）。用无菌吸管吸取05-0.8m1无菌水（生理盐水）到安甑:中。轻轻地旋转安甑以使冻干菌种和无菌水（生理盐水）充分混合并完全溶解；4.4.I.2用无菌吸管将安甑内菌液全部转接到相应的培养基中。然后根据安甑上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度见表24.4.2标准菌种的确认

7、4.4.2.10代菌种应按5.1的方法先进行菌种的复苏后，然后接种于相应培养基平板上非Of弋菌种则直接接种于相应培养基平板或液体培养基后进行确认；442.2菌种在复溶时，可同时划线在平板上以便微生物实验室确认菌种的纯度和特性。接种细菌的培养基平板是胰酪大豆陈琼脂。接种霉菌和酵母菌的培养基平板是沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养条件见表2。培养后，先观察是否有典型的菌落形态，有无杂菌生长，然后挑取单一的菌落进行革兰氏染色，观察其染色特性及菌种形态。根据革兰氏染色标准操作规程来操作。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种；4.423菌种的确认结果,对照下表3,记录在检定菌种鉴定记录表2菌种复苏、划线确认温度

8、及时间菌种名称复苏划线确认培养基名称培养条件划线用培养基培养条件大肠埃希菌胰酪大豆陈液体培养基30-3518-24h胰酪大豆陈琼脂培养基30-35不超过3d金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌生抱梭菌硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基20-2524-48h沙氏葡萄糖琼脂培养基20-25不超过5d黑曲霉菌沙氏葡萄糖琼脂培养基20-255-7d检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第7页共11页表3菌种的菌落形态、革兰氏染色、镜检菌种名称菌落形态革兰氏染色镜检大肠埃希菌圆形，边缘整齐，表面光滑，湿润，且菌落单一革兰氏阴性（红色）两端钝圆的短小直杆，无芽抱金黄色葡

9、萄球菌圆形凸起、边缘整齐，且菌落单一革兰氏阳性（蓝紫色）菌体呈球形，菌体较小，无芽狗，排列呈不规则葡萄状，亦可呈单个、成双或短链排列铜绿假单胞菌菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润、且菌落单一革兰氏阴性（红色）菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。生他梭菌厌氧培养后，应有菌生长，且菌落单一革兰氏阳性（蓝紫色）有卵圆形或球形的芽抱枯草芽袍杆菌生长丰厚，粗糙，不透明不闪光，蜡质，蔓延，奶油色至微褐色，且菌落单一革兰氏阳性（蓝紫色）芽抱杆菌，芽胞为椭圆到柱状，位于菌体中央或精偏。白色念珠菌菌落呈乳白色，表面光滑，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶，且菌落单一革兰

10、氏阳性（蓝紫色）呈卵圆形黑曲霉菌2-3天应为白羊毛状菌丝，后变为粗绒状，抱子慢慢成熟变黑。/4.5标准菌种的传代451复溶菌粉后，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（GD,复壮后转接至斜面或平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（Gz）;1.1.2 取平板上的单个纯种菌落做菌种确认后，挑取斜面或平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，作为长期保存菌种（G2）,作为传代用；同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作和传代用菌种，此为第3代（W3或者G3）;1.1.3 将第2代（Gz）菌种管冷冻长期保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验，将第3代

11、（G3）菌种短期保存后用于制备下一代菌种；检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第8页共11页1.1.4 工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代；455当无标准用菌种时，可从省（市）药检所购买菌种作为传代用菌种，不需经过复溶增菌，但应划线接种确认；456增菌、传代用培养基名称及培养条件见下表4表4菌种增菌、传代培养温度及时间菌种名称增菌传代培养基培养条件培养基培养条件大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽泡杆菌胰酪大豆膝液体培养基30-35C,18-24h胰酪大豆陈琼脂培养基30-35C,不超过3d生抱梭菌硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌沙氏葡萄糖液

12、体培养基20-25,2-3d沙氏葡萄糖琼脂培养基20-25C,不超过5d黑曲霉菌沙氏葡萄糖琼脂培养基20-25,5-7(14.6 检定菌种的标识461检定菌种标识传代后，按7.2检定菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上做标识，标识包括名称、编号、接种口期、传代数等，并填写检定菌种传代记录；4.6.2检定菌种的编号采用字母加数字表示：英文缩写字母一代次（状态）一传代日期一顺序号；如2012年1月12日传代的第1支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为EcG3（X）-120112-01；1）菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）,金黄色葡萄球菌（S.a）,枯草芽抱杆菌（B.s）铜绿假单胞菌（Ra）,

13、生胞梭菌（C.s）,白色念珠菌（C.a）,黑曲霉菌（A.n）2）代数用一位带有下标数字的字母表示：检验用菌种管理制度文件编号：版本号/修订次：生效日期：2第9页共11页传代用菌种用G表示，如G3表示传代用菌种第3代；工作用菌种用W表示，如W3表示工作用菌种第3代；3)表示菌种的状态，分别有干粉F、平板P、甘油管G、斜面X、菌悬液丫等；4)传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。4.7 检定菌种的保管4.7.1 检定菌种设专人管理，并对所保存的菌种建立检定菌种保存、领用登记台账；4.7.2 检定菌种的定期检查：在菌种的保存期间，工作日应每天检查保存菌种冰箱的温度、必要时检查

14、菌种管的塞子是否松动是否染杂菌等，并及时填写检定菌种观察记录，如有异常应及时处理。4.7.3 所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人。4.8 检定菌种的使用4.8.1 微生物检测人员根据检验需要，领取工作用菌种或传代用菌种，同时填写检定菌种保存、领用登记台账；482菌液的制备，见表5表5各菌种菌液的制备方法菌种名称培养基培养条件制备方法大肠埃希菌胰酪大豆陈液体培养基30-3518-24h取增菌后试管震摇均匀，然后用0.9%无菌生理盐水制成含菌数不大于1OOcfuZm1的菌悬液。金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌铜绿假单胞菌生死梭菌硫乙醇酸盐流体培养基30-3518-24h取增菌后试管震摇均匀，然后用0.9%无菌生理盐水制成含菌数不大于100cfum1的菌悬液。白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基20-252-3