指南105诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案.docx

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1、诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、 Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步 Wo Real-timeRT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金 标准。用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物 进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚 集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。 食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。1标本前处理1.1 粪便、呕吐物1.1.1 设备和材料微量移液器、无菌过滤器

2、、漩涡振荡器、微量离心机、1.5ml无 菌离心管、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS） IOmM pH7.0-7.4o1.L2操作方法（1）离心管每管分装0.5mlPBS0用一次性移液管（或无菌棒）添 加豌豆大小的粪便（约0.1克），稀释成约10%至20% （重量/体积） 的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用 500ul的样品。（2）漩涡振荡每个样品1分钟。在5000 rpm下离心5分钟，使 得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于-7（C（3）取澄清的上清液200Ul进行RNA提取。通过阴离子滤膜过滤水样品Q用牛肉膏(1.5%wv)含0.05M甘 氨酸(pH9.

3、0)缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep IOOTM或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。1.2.1 设备和材料DEPC水、新配置次氯酸盐(至少1%)或等效消毒剂、Millipore HAfnter (孔径0.45um、)、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度 计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱(-2(C70。0、Microsep IOO K columns (PALL 公司)、Centriprep YM-50 (MiniPore 公司)、洗脱液 (BE-0.05GIyPH7.0)、PBS (pH7.2),离心机、氯仿、丁醇。1.2.2 操作方法1.2.2.

4、1 过滤装置准备(1)使用无菌的镜子将滤膜放在滤器架上，滤膜有三层，型号分 别为 Millipore HAfilter AP15 和 AP20,放置顺序为 Millipore HAfilter f AP15 AP20o注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的 那边向下。所有的玻璃器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。(2)将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边Q(3)使用不锈钢滤器夹进行水的密封Q(4)真空泵连接IoOOml的锥形瓶。注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安 全柜进行操作。(5)向滤器中倒入20ml无菌水(DEPC水)检查滤膜的密封情况。（6

5、）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。1.2.2.2 水样品的过滤（1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。（2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。1.2.2.3 用酸漂洗滤膜将膜用无菌的镶子夹放在有200ml 0.05mM H2SO4 （pH3.0）的无 菌500ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+o1.2.2.4 洗脱（1）将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml洗脱液。盖 上铝箔。注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。（2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速45rpm,室温（23C 3）, 15mino（3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。1.

6、2.2.5 中和洗脱液用INHCl或INNaoH调整洗脱液的PH到7.0-7.4。检测前，洗 脱液在-70。C储藏。1.2.2.6 二次浓缩方法一：用 Microsep IOO K columns 或 Centriprep YM-50 浓缩病（1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器Q(2)将水标本滤膜洗脱液(大约5ml)加入到浓缩柱中，5000rpm离心5mino(3)吸取浓缩液(约150l),转移至1.5ml离心管中。方法二：PEG沉淀(1)向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3molL (若洗脱液为 5ml加0.08775g的NaCl),有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG

7、-6000 终浓度为12.5% (wv)(若洗脱液为5ml,加0.0625g的PEG-6000o 4过夜Q(2) 4, IOOOOrPm离心30分钟,收集沉淀。(3 )Millipore HA filter,倾倒并弃掉上清液。每个离心管添加150 500l pH7.2 ( 0.2) PBS重悬沉淀物。将离心管放置在离心管架上， 为更好的让缓冲液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。室温 放置30mino注意：如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。 吹打过力会产生气泡(4)向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇(1:1 vol/vol)混合。去除 病毒悬液中的抑制剂。(5) 4, IOO

8、OOrprn,离心 20 分钟。(6)分离出水相(上清液)，80储藏。(7)取200l上清液进行核酸提取。1.3环境涂抹样L 3.1将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面(最大面积IOOcm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中（QlAanIP试剂 盒560l, Genaid试剂盒400l）,将棉签用力压EP管的侧壁，释放棉 签中的液体。重复浸入和压侧壁的步骤3-4次，确保病毒最大释放 量，直接进入核酸提取步骤。1.4食品1.4.1 贝类1.4.1.1 设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、高速离心机（可 离心15mL50mL体积）、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实 时

9、荧光定量PCR检测系统、眼科剪、眼科镶、一次性无菌培养皿、 恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器（LXI34M0）、一次性研磨杵（上 海生工）、15mL 去 RNAase 离心管、1.5mL 去 RNAaseEppendorf 管、 20L 200L IOOoL 微量移液器、PBS 溶液 pH7.2 （Gebico）. 蛋白酶K （PCR级Roche）o1.4.L2贝类样品处理程序1.4.1.3解剖方法5个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。如果一件样品的消化腺和肠道的总质量不够2.0g,应适当增加 取样量，使得每件样品检验的总质量达到2.0g。(1)牡蛎的解剖方法使用灭菌

10、的刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌的眼科剪和眼科镶，先 将牡蛎的内脏部分剪取下来放到一个灭菌的平皿里，沿肠道将牡蛎软 体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余的组织去掉，取其消化腺 和肠道用于检测。牡蛎的解刨过程及解剖结构见下图。(图片源自http:/ww2.mdsg.umd.edu/interactive_lessons/oysters/anatlab/lab_i.htm)(2)海虹用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镜子直接夹下，同时尽量将 肠道取下。由于海虹的消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样的海 虹个体数，以使得总质量达到2.0g,用于后续的检测。海虹的解剖结 构见下图，图中镶子所指的位置为海虹

11、的消化腺。(图片由中国食品药品检定研究院生物检测室提供)(3)扇贝、毛蜗与文蛤扇贝与毛始的解剖结构与海虹相似，参照海虹的方法将壳打开 后，直接判断消化腺所处的位置，用眼科镜和眼科剪，将其消化腺 和肠道取下用于诺如病毒的检测。文蛤的消化腺包在内脏团里，在 解剖时可以直接用镜子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下， 同时将肠道取出，用于检测，文蛤的消化腺体积较小，需要适当增 加取样量以满足检验的要求。L4.L4均质将上述解剖下的消化腺和肠道放到50mL灭菌的小烧杯内，用电 磨均质器(LX134MO)将消化腺仔细打碎，成糊状Q1.4.1.5蛋白酶K消化将上述均质的消化腺，分别称取2.00.1g,加入

12、15mL的离心管， 然后每管加入2mL的PBS溶液，加入20mgmL蛋白酶K (Roche) 溶液10L进行消化，另外取1件样品加入诺如病毒的阳性质控球, 作为外部质控阳性对照。1.4.1.6将上述样品于摇床37, 32OrPm振荡lh。恒温水浴60, 保持15min;将15mL离心管，300Og离心5min,取200L用于 RNA的提取，剩余部分冷冻保存，用于复检。1.4.2三文鱼1.4.2.1设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食 品均值器、天平：感量0.1 g、高速低温离心机（4 , 10000 g）. 5PEG8000/NaCl 溶液（PEG8000 500

13、2g, NaCI 87lg,先用 450mL 蒸偏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至IooomL, 121t, 15min灭 菌）、磷酸盐缓冲液（PBSPH 7.2）、TriS/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE） （TriSbaSel2.1 0.2g,甘氨酸 3.80. 1g,牛肉膏 101.0g,蒸德水 1000lmL, 121, 15min灭菌）、氯仿/正丁醇（1:1体积比）溶液。1.4.1.2样品处理程序及方法三文仅25g44 ml TG网I4 V. lOOg min1/4 K枳很厂5、PG溶液4,. 60rmin箴荡60 min414 C. lOOg内心30 minPBS哌息鲍仿/1E亍龄

14、IS4 X? . lOOg成心工5 minI 提 MZRNAl(1)取三文鱼样品25 g,剪碎后置于带滤网的均质袋中，加人TGBE缓冲液40 mL,均质均匀，于室温60 r/min震荡20 min。(2)取滤液至50mL新的离心管中，4 , 10000g离心30min0(3)取上清液(小心避开液体表面的油脂层)，加入上清液1/4 体积的 5PEGNaCl 溶液，颠倒 60s, 4 , 60 r/min 震荡 60 min。(4)将上述溶液于4 , IooOog离心30 min,弃去上清液。 向沉淀物中加入PBS溶液700 L,震荡重悬。(5)加入与上述重悬液等体积的氯仿/正丁醇(1:1)溶液，

15、充分 振荡，室温孵育5min。于4 C, IOooOg离心15 min。(6)取上层水相液体200 L用于提取病毒RNA。1.4.3草莓、蓝莓1.4.3.1 设备和材料诺如病毒质控样(中国食品药品检定研究院)、PEG8000 (Polyethylene glycol)、氯化钠(NaC1)、氯化钾(KC1)、碳酸氢钠 (NaHCO3)、磷酸二氢钾(KH2PO3)、磷酸氢二钠(Na2HPO3)、NaOH 溶液(5M)、HCI溶液(IM)、纯水(MiniQ系统净化)、氯仿(Methenyl trichoride) 丁醇(I-BUtanoI)、牛肉膏(BeefEXtraCt)、甘氨酸(GIyCine)、 蛋白酶 K (Proteinase K)、果胶酶(Pectinase from Aspergilus niger, Sigma)、5PEGNaCl 缓冲液(PEG80005002g, NaCI87lg,先用 450mL蒸偏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000mL, 121, 15min 灭菌)、TGBE 缓冲液(TriSbaSeI2.1 0.2g,甘氨酸 3.80. 1g, 牛肉膏 10L0g