PCR在检验检疫中的应用.docx

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1、PCR在检验检疫中的应用PCR是聚合酶链式反应（Po1ymeraseChainReaction）的简称，是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，曾获得1993年的诺贝尔化学奖。核酸扩增的灵敏度高、特异性强，对样本纯度要求低，且快速灵敏，简单易操作，在分子检测方面具有独特优势，是生物学研究的有力工具。对单个基因研究、序列分析、突变体及重组体构建、基因表达、基因组克隆、反向测定未知DNA区域、病原微生物检测等生物科技领域的发展起到了巨大的推动作用。一、PCR的工作原理在TaqDNA聚合酶（热稳定DNA聚合酶）的作用下，由一对特异性引物经热变性-退火-延伸反应，三个不同温度的循环处理使得D

2、NA由少量扩增到多量的一种体外DNA扩增技术。在反应体系内，以一对人工合成的寡核甘酸作为扩增引物，第一步，模板DNA变性，以构成脱氧核糖核酸的四种脱氧核甘酸为底物，目的基因作为模板，在DA聚合酶的作用下模板DNA经过80-90。C高温变性，使模板DNA双链经PCR扩增形成的双链解离成单链。第二步，模板DNA与引物退火（复性），模板DNA解离成单链后温度降至50-6（TC,引物与模板DNA单链互补配对。第三步，引物的延伸，DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶作用下，70-75。C以dNTP为反应原料半保留复制合成一条新的模板DNA链。这三个步骤为一个循环，2-4分钟即可完成一个循环，2-3小时就

3、能使极微量的DNA片段、甚至单拷贝基因复制到几百万倍，从而实现对靶DNA的放大。由于扩增碱基序列按照靶DNA复制，因此PCR反应具有高度特异性。二、PCR在家禽诊断中的应用沙门氏菌：沙门氏菌病是由各种类型的沙门氏菌引起的人、家畜、家禽食物中毒、急性肠胃炎和腹泻的疾病。酚提取法和裂解法制备PCR模板和PCR诊断试剂盒检测出自然发病动物粪便血液中的沙门氏菌，发现试剂盒中阳性率比培养法高。鸡支原体：引起幼龄鸡的慢性呼吸道疾病，用PCR技术能检出鸡支原体的DNA模板。PCR技术不仅可以用于细菌病的检测，也可用于螺旋体、病毒的检测，尤其是对于一些难以检验出的病毒，PCR可快速检测诊断。鸡传染性喉气管炎：

4、是由鸡传染性喉气管炎病毒引起的一种急性呼吸道疾病，该病在临床上易与新城疫和传染性支气管炎相似，较难区分，病原分离和血清学办法繁琐且特异性较差，不能满足实验室诊断需要，而PCR法可检出IOPb的鸡传染性支气管炎病毒DNAo二十世纪Kram等人建立了鸡传染性法氏囊病和鸡传染性贫血病毒的PCR检测方法。三、PCR在家畜诊断中的应用1iuST等建立了一套快速从组织中检测猪瘟（CSFV）病毒的PCR方法，从感染CSFV组织中分离总RNA,用反转录酶AMV进行反转录，用TapDNA聚合酶以两对待异性引物将CSFVCDNA扩增，扩增片段用琼脂糖凝胶电泳进行检测，当DNA被一对套引物进行再扩增，PCR产物DN

5、A序列分析显示，从当地分离毒株进行扩增的猪瘟病毒序列与A1for株有同高度同源性，敏感性将提高IOOO倍。傅烈振等根据已报道的CSFV核甘酸序列，选择保守性较强的5端非编码区设计引物，用RT-PCR从至少IOPg的兔脾RNA中特异地扩增出预期的片段。2003年，罗廷荣等针对CSFV与同属的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）存在较强的交叉免疫反应，设计不同引物，通过RT-PCR能分别扩增出CSFV和BVDV的特异性核酸片段，能将CSFV和BVDV分开，这已打破了血清学方法所不能解决的CSFV和BVDV的交叉反应问题。四、PCR在宠物诊断中的应用据TrUyenU等报道，犬细小病毒（CPV）是20世纪70

6、年代中期在犬中出现的一种新的流行性疾病病毒，该病毒与猫瘟热病毒很相似。近年来研究表明，犬细小病毒可能是其他猫瘟病毒变异而来。猫瘟热病毒和犬瘟热病毒分离株的衣壳蛋白基因已被克隆和测序，几个保守的氨基酸发生了改变，PCR可使被保存不能作为感染介质的病毒样品研究更容易。例如，从已经用福尔马林固定和石蜡包被了15年而感染样品中，用PCR可扩增出犬细小病毒DNA。HaraSaWaR等PCR进行扩增犬细小病毒和猫瘟热病毒的NS1和VP1/VP2基因，在这些细小病毒中比较扩增的DNA片段限制酶切图谱，其中疫苗株和野毒株在NS1区域的限制酶切位点是不同的，在犬细小病毒和猫瘟热病毒之间NS1区域的限制酶切点也不

7、同，所以以PCR为基础的限制酶切可作为类似病毒生态学的研究。同年,HirasawaT等发展了套式PCR是IO11ybg-1013ybg,该方法对从粪渣中检测病毒是很有用的。随着PCR技术发展，刘忠华等通过在犬细小病毒的基因组中设计的个特异性寡核甘酸引物，利用PCR技术首次研制犬细小病毒PCR诊断试剂盒。在特定的反应条件下，使用该试剂盒特异扩增还有犬细小病毒样品，且能检测出痕量（IOng）的犬细小病毒DNA,被测粪样只需进行简单煮沸就能进行PCR反应，该试剂盒能在常温保存一周以上、4。C保存1年以上。同血凝试验及单克隆抗体E11SA方法比较，对66份样品进行检测，显示该PCR试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优点。五、PCR存在的弊端1.由于PCR灵敏度极高，实际应用中污染较严重，一旦有少量外源性污染就可出现假阳性结果。2,条件控制不当会造成各种产物突变，从而降低特异性和灵敏度。3.PCR技术需要以已知DNA模板作为扩充模板，必须知道引物的结合部位序列才能合成特异性引物，局限性较大。