植物DNA提取方法总结.docx

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1、植物DNA提取方法总结实验内容采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA,并进行纯度分析和糖凝胶电泳。目的要求掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。实验原理1、原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使被释放出来。在浓氯化钠溶液(12mo11)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14mo11)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白

2、的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。用十二烷基硫酸钠()等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNAo用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注

3、入两倍体积的95%乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA,可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：化学因素，核酸的结构在PH值4.011.0间较稳定，PH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于

4、收集，应加以避免。醐的作用，细胞中普遍存在的在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温（TC左右）下进行。常用的酹抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、珅酸盐、乙二胺四乙酸盐、（ETDA-Na）等。和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使被破坏而失活。2、DNA的提取原理（1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨,破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNAo（2）SDS法是植物总DNA的提取方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入

5、SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAC可使SDS一蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。3、DNA的浓度测定和纯度分析（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钳酸铉溶液，钳酸钺能与无机磷酸定量结合成磷铝酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的铜蓝，在660nm处有最大光吸收。（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nmo1ugm1的DNA溶液A260=0.020,IugZm1的RNA溶液或单链DN

6、A的A260=0.0220.02401个A260相当于50ugm1的DNA,40ugm1的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm,多糖的最大吸收在230nmo纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。试剂和器材：（1） 1M-c1（pH8.0）500m1：60.57g,pH8.0（2） CTAB分离缓冲液2%CTAB,1.4mo11NaC1,20mmo11,100mmo11Tris-HC1（pH8.0）,0.2%翦基乙醇共100m1：2gCTAB,8.18gNaC1,0.74g.Na2.2H2O,加入10m11mo11的Tris-HC1（PH8.0）

7、,0.2m1疏基乙醇，加水定容到IOOm1。洗涤缓冲液76%乙醇，10mmoI/1乙酸镂共IOOmI：76m1无水乙醇，0.077g乙酸钺,加水到IOOm1。TE缓冲液IOmmo1/1Tris-HC1(pH7.4),1mmo11EDTA氯仿-异戊醇(24：1)o液氮。(7),恒温(37100),。操作方法：(1)将Wm1CTAB分离缓冲液加入50m1中，置于60中预热。(2)称取1.5g叶片，置于预冷的中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。样品于65保温30分钟。加等体积(IOm1)的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。室温下4000rpm

8、离心10分钟。(7)用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。(有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA,或者是云雾状的DNA,如果看不到DNA,样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜)。(8)用下述方法收集DNA：如果呈可见的丝状DNA,可用玻璃棒搅起，转移至10-2Om1洗涤缓冲液中。如果DNA呈云雾状，可在200OrPm离心1-2分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加10-2Om1洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来。洗涤至少20分钟。(10)按照(8)法重新收集核酸，并按照(9)法二次洗涤。(11)用玻璃棒

9、搅出沉淀或200OrPm离心10分钟。小心倒去上清液，在室温下使DNA沉淀干燥。(12)将DNA沉淀溶于11.5m1TE中，分装后一20保存备用。(13)取IOOu1稀释20倍，测定A260,A280,A230,或作出吸收200-400nm并计算浓度和得率。(14)取51Ou1DNA溶液做0.7%的糖电泳，检查DNA的大小和质量，以入-DNAZHindIH做分子量标准，另取5u1做限制性酶切。注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。表一GUS染液配方成分Mm(g)终浓度(mmo11)Na2PO412H2O358.1412.28950NaHPO42H2O156.012.44750K3Fe(CN6)329.250.6470.5K4Fe(CN6)3H2O422.390.21120.5X-G1uc521.791.0242