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1、肝酯酶(Hepatic1ipase,H1)试剂盒说明书微量法IOoT48S注意正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：肝酯酶是脂肪分解酶，在肝实质细胞中合成，存在于肝脏窦周间隙内皮细胞表面和窦周间隙腔面的肝细胞微绒毛表面，可促进脂蛋白中的胆固醇向类固醇激素转化，血浆中的H1活性增高时，血浆中小颗粒可导致1D1水平升高，加速动脉粥样硬化的发生。测定原理：肝酯酶水解-乙酸茶酯产生-莱酚，可与固蓝B盐形成紫红色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，颜色深浅在一定范围内与肝酯酶活性成正相关。自备实验用品及仪器：天平、冷冻离心机、研钵、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/
2、%孔板。试剂组成和配制:试剂一：液体I1om1XI瓶，4保存。试剂二：液体Im1XI瓶，4C避光保存。试剂三：液体8m1i瓶，4C保存。试剂四：液体Im1X1瓶，4C避光保存。样品处理：1 .组织：按照质量(g)：试剂一体积(m1)为1：510的比例(建议称取约0.1g,加入Im1试剂一)加入试剂一，冰浴匀浆后于4C,IOOOOg离心IOmin,取上清待测。2 .细胞：按照细胞数量(IO4个)：试剂-体积(m1)为5001000:1的比例(建议500万细胞加入Im1试剂一)加入试剂一，冰浴超声波破碎细胞(功率3(X)w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min)：然后于4C,1000Og离心Iomi
3、n,取上清待测。3 .血清：直接测定。测定操作：对照管测定管样品(1)2020试剂一(1)9080试剂二(1)10混匀，30水浴IOmin试剂三(1)8080试剂四(1)1010充分混匀，30静置5min,于微量石英比色皿/96孑值，记为A对照管和A测定管，A=A测定管-A对J板,测定595nm处吸光照管计算公式：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=0.1519X-0.1241,R2=0.99941 .按照蛋白浓度计算鲜活性定义：每毫克蛋白每分钟水解乙酸蔡酯产生1mo1a-蔡酚为一个酶活力单位。H1活性(mo1ZminZmgprot)=(A+0.1241)0.1519xV反总(
4、V样XCPr)T=6.58(A+0.1241)Cpr2 .按照样本质量计算障活性定义：每克组织每分钟水解乙酸蔡酯产生1mo1茶酚为一个酶活力单位。H1活性(mo1ming鲜重)=(A+0.1241)N).1519xV反总(WXV样V样总)T=6.58(A+0.1241)W3 .按照细胞数量计算酶活性定义：每IO。个细胞每分钟水解乙酸菜酯产生1mo1a茶酚为一个酶活力单位。H1活性(mo1ZminZ1O4Ce11)=(A+0.1241)0.1519xV反总(V样X细胞数量V样总)T=658(A+0.1241)细胞数量4 .按照液体体积计算酶活性定义：每亳升血清每分钟水解a乙酸蔡酯产生1mo1a-
5、蔡酚为一个酶活力单位。H1活性(moiminm1)=(A-K).1241)0.1519xV反总V样=6.58(A+0.1241)V反总：反应总体积，0.2m1；V样：反应体系中加入样本体积，0.02m1：W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积,1m1；T：反应时间，IOminb.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y=0.076X-0.1241,R2=0.99941 .按照蛋白浓度计算障活性定义：每亳克蛋白每分钟水解a-乙酸蔡酯产生1mo1a-蔡酚为一个酶活力单位。H1活性(mo1minmgprot)=(A+0.1241)0.076xV反总(V样XCPr)T=13.16(A+0.1241)
6、Cpr2 .按照样本质量计算酶活性定义：每克组织每分钟水解a-乙酸蔡酯产生1mo1a-蔡酚为一个酶活力单位。H1活性(mo1ming鲜重)=(A+0.1241).076V反总(WxV样V样总)T=13.I6(A+0.1241)W3 .按照细胞数量计算酶活性定义：每IO,个细胞每分钟水解a-乙酸蔡酯产生1mo1a-蔡酚为个酶活力单位。H1活性(mo1minIO4ce11)=(A+0.1241)0.076xV反总(V样X细胞数量V样总)T=13.16(A+0.1241)细胞数量4 .按照液体体积计算障活性定义：每亳升血清每分钟水解a-乙酸蔡酯产生1mo1a-蔡酚为一个酶活力单位。H1活性(mo1minm1)=(A+0.1241)0.076V反总V样T=13.I6(A+0.1241)V反总：反应总体积，0.2m1；V样：反应体系中加入样本体积，0.02m1：W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积,1m1：T：反应时间,IOmin
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