人类CYP2C19检测的标准操作程序.docx

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1、人类CYP2C19检测的标准操作程序【目的】保证检测结果准确可靠。【适用范围】适用于本实验室的检验人员。【该SOP变动程序】本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。【试剂】1试剂名称：人类CYP2C19基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）2 .生产厂家：武汉友芝友医疗科技股份有限公司3 .包装规格：20人份/盒4 .试剂盒组成：管号标签名称主要组分装量规格（20人份/盒）1 CYP2C19*2反应液PCR缓冲液、特异性引物和探针、内标引物、探针和模板、Taq酶、UNG酶1管（480）2 CYP2C19*3反应液PCR缓冲液、特异性引物

2、和探针、内标引物、探针和模板、Taq酶、UNG酶1管（480H1）3 CYP2C19*17反应液PCR缓冲液、特异性引物和探针、内标引物、探针和模板、Taq酶、UNG酶1管（480）4 弱阳性对照CYP2C19*2G和CYP2C19*2A、CYP2C19*3G和CYP2C19*3A,CYP2C19*17C和CYP2C19*17T的质粒混合液1管（200H1）5 空白对照Tris-HCI缓冲液（IOmM）1管（200HI）贮藏条件及有效期：试剂盒应置205避光存放9个月。【仪器设备】1 .本试剂盒适用于StratageneMX3000P、AB75001ightCycIer480等实时荧光定量PC

3、R仪。2.本试剂盒要求仪器使用FAM、VIC通道采集不同多态性的CYP2C19基因扩增荧光信号，使用ROX通道采集内标基因扩增荧光信号【预期用途】该产品用于定性检测全血样本的CYP2C19基因CYP2C19*2CYP2C19*3和CYP2C19*17三个位点的多态性检测。本产品检测结果仅代表对人类CYP2C19基因的检测结果，为临床医生个体化用药提供参考。本试剂盒仅用于临床铺助诊断，具体临床应用时，临床医生需结合病例的实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。CYP2C19是CYP450家族中最重要的药物代谢酶之一，许多内源性底物、以及临床上大约2%的药物都由其催化代谢。

4、研究发现CYP2C19可影响到氯毗格雷、奥美拉喋、地西泮、苯妥英钠等许多重要临床应用药物的代谢，而其基因多态性是引起个体间和种族间对同一药物表现出不同代谢能力的重要原因之一。CYP2C19基因野生型为CYP2C19*1*1型，中国人群中较常见的等位基因型是CYP2C19*2型、CYP2C19*3型和CYP2C19*17型，其中CYP2C19*2型和CYP2C19*3型可引起CYP2C19基因编码的酶活性减弱，代谢底物的能力减弱，造成活性代谢产物不能生成，导致氯口比格雷抵抗。此基因型携带者称为弱代谢者,中国人群中的弱代谢者99%为*2和*3型等位基因。CYP2C19*17型可引起CYP2C19基

5、因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强，此基因型携带者称为强代谢者。2010年美国FDA要求氯口比格雷药物标签上注明CYP2C19与疗效的关系，并建议使用前检测CYP2C19基因的多态性。【检验原理】本试剂盒针对CYP2C19基因三个位点的不同多态性，设计3套特异性引物和探针组合，一个反应体系中通过两种不同通道检测一个位点的基因多态性。在反应体系中含有不同基因型模板的情况下，PCR反应得以进行并释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。【标本要求】本试剂盒适用于2m1EDTA抗凝新鲜全血中提取人类基因组DNA的检测。所提取DNA需用

6、紫外分光光度计测定浓度及纯度，要求DNA的A260/280在1.8-2.0之间，-20以下保存，避免反复冻融。【检验方法】1 .试剂准备：（试剂准备区）1）从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温，各组分充分融解，快速离心10秒。2）核算当次实验所需要的反应数（n）,按照231/孔分装量将每种反应液,分别分装到n个反应管内。PCR反应管转移至样本准备区,剩余试剂放回20C5C冰箱冷冻避光保存。n=样本数+空白对照（IT）+弱阳性对照（IT）2 .样本准备：（样本准备区）1）样本DNA提取:推荐使用天根血液基因组DNA提取试剂盒（T1ANamPB1OOdDNAKitDP318）用于血液基因组DNA的提取。

7、所提取DNA需用紫外分光光度计测定浓度及纯度，要求DNA的A260/280在1.820之间。2）加样：a）将待测样本的基因组DNA.弱阳性对照、空白对照，分别加入已装有3种PCR反应液的反应管中，即每个待测样本分别用此3种PCR反应液进行检测，加入量为21o待测样本的基因组DNA推荐浓度为5-15ngUI。b）盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况。将PCR反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。若PCR反应管内加入模板后遇临时情况不能立即上机，建议将加好模板的PCR反应管放于28条件暂时保存，并在24小时内尽快上机检测。3 .PCR扩增：（核酸扩增区）1）开机，并进行仪器性能自检。2）取样本准备区

8、准备好的PCR反应管，放置在仪器样品槽相应位置。并记录放置顺序。3）按表3设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增。反应结束后，根据扩增曲线，划定合适基线（一般起始设定为3,终止设定为15）和荧光阈值（一般将阈值划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中间），得到不同通道Ct值并按照说明书进行结果判定。体系总体积为25I信号采集CYP2C19*2反应液CYP2C19*2G-FAM通道采集荧光信号CYP2C19*2A-VIC通道采集荧光信号CYP2C19*3反应液CYP2C19*3G-FAM通道采集荧光信号CYP2C19*3A-VIC通道采集荧光信号CYP2C19*17反应液CYP2C19*17C

9、-FAM通道采集荧光信号CYP2C19*17T-VIC通道采集荧光信号内标系统内标基因一ROX通道采集荧光信号PCR反应条件阶段条件循环数40UNG处理37：10分钟（min）1预变性95：5分钟（min）1PCR95C:15秒（s）62：60秒（s）（设置在此阶段结束时采集荧光信号）【检验结果的解释】1 .试剂盒有效性判定：1）弱阳性对照：FAM、VIC通道Ct值30,扩增曲线有明显指数增长期。2）空白对照：FAM、VIC通道无扩增曲线，或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期，无Ct值或Ct值238。3）内标基因：ROX通道Ct值W32,有明显扩增曲线。检测样本的反应管中，若FAM、

10、VIC通道有信号，ROX通道信号较低或无信号，此为样本基因组DNA加入过量，建议将样本稀释至合适浓度后进行检测。2 .检测结果的判定：按照下表4对样本检测结果进行判定，确定样本基因多态性。表4：结果判定反应液基因型FAM通道VIC通道CYP2C19*2反应液CYP2C19*2位点G/G纯合野生Ct值36Ct值36或无Ct值CYP2C19*2位点G/A杂合突变Ct值W36Ct值36CYP2C19*2位点A/A纯合突变Ct值36或无Ct值Ct值36CYP2C19*3反应液CYP2C19*3位点G1G纯合野生Ct值W36Ct值36或无Ct值CYP2C19*3位点G/A杂合突变Ct值W36Ct值36C

11、YP2C19*3位点A/A纯合突变Ct值36或无Ct值Ct值36CYP2C19*17反应液CYP2C19*17位点C/C纯合野生Ct值W36Ct值36或无Ct值CYP2C19*17位点C/T杂合突变Ct值W36Ct值36CYP2C19*17位点T/T纯合突变Ct值36或无Ct值Ct值36【检验方法的局限性】1样本检测结果与样本的收集、处理和保存过程有关，其中任何失误都将导致检测结果的不准确。如果样本处理时未控制好DNA的质量，可能出现假阴性的结果。2.本试剂盒未包含全部的人类CYP2C19基因型别，因此当本试剂盒检测结果为阴性时，并不能排除被检测者带有人类CYP2C19基因位点。本试剂盒检测结

12、果仅供临床参考，用于指导个体化用药，不得作为临床诊治的唯一依据。【产品性能指标】1试剂盒包装完整，无内容物溢出；标签外观完整，无脱落，标签标识内容清晰；试剂盒内组成正确，无重复、缺失组份的情况2 .使用试剂盒3种反应液检测CYP2C19基因突变型参考品，应检测出对应突变。3 .使用试剂盒3种反应液检测CYP2C19基因野生型参考品，应不得检出突变。4 .试剂盒最低检出限可达到：Ing样本中能准确检测出对应基因型。5 .使用试剂盒重复检测对应基因型参考品10次，应检出对应基因型，且检测结果Ct值变异系数CV5%o【注意事项】1 .实验前请仔细阅读本说明书；2 .每次实验应设置阴性对照品；试剂使用

13、前应充分融化并混匀；自备灭菌生理盐水；3 .反应管中应尽量避免气泡的产生，管盖需盖紧；4 .实验室必须严格遵循PCR基因扩增实验室的管理规范，操作人员必须经过培训I,合格后方能上岗；5 .实验过程严格分区进行，即试剂准备区、样本处理区和PCR检测区，各区的白大衣、手套和帽子等不能带入其它区域，各区仪器设备不能带入其它区域；6 .请使用无菌带滤芯吸头，实验中废弃的吸头应弃于含10%次氯酸钠的废液缸中；实验全过程必须带一次性手套；7 .扩增结束后不要打开管子，应密封丢弃于指定容器中；8 .实验完毕用10%次氯酸钠或75%酒精清理实验工作台及移液器等相关物品，并用紫外灯照射；9 .不同批号的试剂不得混用，请勿使用过期产品；10 .请根据所使用荧光PCR仪选择相配套的PCR管/板。11 .仅用于体外诊断。