谷氨酸合成酶GlutamatesynthaseGOGAT试剂盒说明书微量法100管96样.docx

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1、谷氨酸合成酶(Ghitamatesynthase,GOGAT)试剂盒说明书微量法100管/96样注意,正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义:GoGAT广泛分布于植物中,和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环,参与氨同化的调控。渊定原理:GoGAT催化谷翅酰胺的氨基转移到胡戊二酸,形成两分子的谷氨酸;同时NADH氧化生成NAD,34Onm吸光度的下降速率可以反映GOGAr活性大小。需自备的仪器和用品:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂组成和配制:提取液:液体IOom1X1瓶,4e保存:试剂一:液体

2、20m1x1瓶,4保存;试剂二:粉剂x2瓶,4C保存:粗液提取:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(IO4个):提取液体积(m1)为5001000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入Im1提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g4C离心IOmin,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(m1)为1:570的比例(建议称取约0.1g组织,加入Im1提取液),进行冰浴匀浆。8000g4已离心IOmin,取上清,置冰上待测。渊定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上

3、,调节波长至340nm,蒸储水调零。2、样本测定(1)在试剂二中加入9m1试剂一充分溶解混匀,置于37C(哺乳动物)或25C(其它物种)水浴5min;现配现用(配好后3h内用完);(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20P1样本和180U1试剂二,混匀,立即记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2,计算AA=AI-A2。GOGT活性计算:a.用微量石英比色J1溺定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmo1/min/mgprot)=AAV反总子(d)109(VWCpr)T=

4、32IACpr(2)按样本鲜重计算:单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GoGAT(nmo1/min/g鲜而)=QAxV反总+(d)x1()9(WxV样V样总)T=32AA+W(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmo1minIO4ce11)=AAV反总(d)x1()9+(50OXV样V样总)T=0.642AAV反总:反应体系总体枳,21041;:NADH摩尔消光系数,6.221031/mo1/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02m1;V样总:加入提取液体

5、积,1m1;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/m1;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1的NADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmo1/min/mgpro()=AAxV反总(d)109(VWCpr)T=643ACpr(2)按样本鲜重计算:单位的定义:银g组织每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmo1/min/g鲜重)=QAxV反总子(d)I09(WVWVW,.)T=643AW(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。GOGAT(nmo1minIO4ce11)=AAV反总子(d)x1()9(500V样V样总)T=1.286AAV反总:反应体系总体积,210-41;:NADH摩尔消光系数,6.221031/mo1/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02m1;V样总:加入提取液体积,1m1;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/m1;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。优利科(上海)生命科学有限X

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