中国药典2023版鲎试剂细菌内毒素检查预试验SOP.docx

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1、1目的建立细菌内毒素预试验操作规程，以指导检验人员的正确规范操作，为保证细菌内毒素检查凝胶法的准确性提供依据。2适用范围适用于细菌内毒素检查法的“赏试剂灵敏度匏核试验”和“干扰试验”。本规程参照中国药典2023年版四部-1143细菌内毒素检查法制定。3职责进行细菌内毒素检查的操作人员严格按本规程进行操作。4内容1.1 基本原理1.1.1 本法采用凝胶法，系通过宣试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。1.1.2 曾试剂灵敏度夏核试验：当使用新批号的赏试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行赏试剂灵敏度复核试验。1.1.3 干扰试验：当进行新药的内毒素

2、检查试验前，或无内毒素检查项目的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当赏试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。1.1.4 本试验操作过程应防止内毒素的污染。1.1.5 1.5EU：内毒素单位，IEU与1个内毒素国际单位（IU）相当。1.1.6 1.6：宣试剂的标示灵敏度，单位：EU/m101.1.7 MVD：最大有效稀释倍数，指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数。1.2 材料准备4. 2.1细菌内毒素工作标准品：应经细菌内毒素国家标准品为基准标定效价；5. 2.2邕试剂：当使用新批号前，按细菌内毒素预试验S0P进行灵敏

3、度检查；4.2.3细菌内毒素检查用水（BET水）：内毒素含量应V0.015EUm1,且对内毒素试验无干扰作用；4.2.4供试品溶液：PH宜在6.08.0范围内，否则用已去除内毒素和干扰因子的酸、碱溶液或缓冲液调节。4.3 器具准备4. 3.1移液枪、一次性除热源枪头（IOOoU1、200P1）；5. 3.2剪刀、砂轮片、试管架、除热源试管、医用胶布；6. 3.3恒温培养箱（371）、旋涡混合器、洁净工作台。4.4 量试剂灵敏度复核试验4.4.1试验过程：4.4.1.1根据当批数试剂的标示灵敏度（）,把细菌内毒素工作标准品用适量BET水充分溶解，避免产生气泡，在旋涡混合器上混匀15分钟。4.4.

4、1.2将工作标准品用BET水制备成2入、0.5入、0.25四个浓度的“内毒素标准溶液”备用。.注意：工作标准品稀释过程中，每步稀释应不超过10倍，每稀释一步应在混合器上均匀至少30秒。4.4.1.3取18支宜试剂，按图1排列标注好，每支加入0.1m1BET水。注：取用宣试剂时，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮片在瓶颈轻轻划痕，开启备用，注意防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.Im1检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核赏试剂的规格不是0.Im1/支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的宣试剂溶液混和在一起，然后每0.Im1分装到试管中。4.4.1.4其中16管加入不

5、同浓度的“内毒素标准溶液。每支0.Im1每个浓度平行做4管，按浓度高至低依次加入。4.4.1.5另外2管加入BET水，每支0.Ini1,平行做2管作为阴性对照。4.4.1.6将溶液轻轻混匀后，用医用胶布封口，垂直放入恒温培养箱（37C1C）中，孵育602分钟。注意：保温和拿取试管过程应避免受到振动而造成假阴性。4.4.1.7孵育结束后将试管轻轻取出，缓缓倒转180。4.4.1.8若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者，为阳性；若未形成凝胶，或形成的凝胶不坚实、变形、从管壁滑脱者，为阴性。4.4.2结果判定：4.4.2.1当最大浓度2人的平行管均为阳性，最低浓度0.25人的平行管均为阴性

6、，阴性对照的2支管均为阴性，则试验有效（如图1）。如果入C不在此范围，本批邕试剂不能使用。需查找原因，可能是灵敏度标示不准确或内毒素效价标示不准确，或操作不当所致。图1量试剂灵敏度复核试验2O,5025器4.4.2.2按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为赏试剂灵敏度的测定值（入c）。c=anti1g(X/4)式中：X为反应终点浓度的对数值(1g)。反应终点浓度是指系列递减的内揖素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。4.4.2.3当入C在0.52(包括0.5人和2入)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度人为该批赏试剂的灵敏度。举例：设待复核宣试剂的灵敏度为0.25EUm1,实验结果如下:内

7、毒素浓度(EUm1)0.500.250.1250.062阴性对照反应终点浓度(X)1+-一一0.252+-一一0.53+-0.1254+一0.125则：c=anti1g(X4)=anti1g(1g.25+1g0.50+1g0.125+1g0.125)/4=antiIg(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4=antiIg(-0.508)=0.310(EUm1)入C在在0.5入2人范围内，符合要求。注：anti1g是Ig函数的反函数，在exce1里可以用power公式，power(数值)4.5干扰预试验4. 5.1供试品阴性对照(NPC)：取供试品原液用BET水以1:2、1:4、

8、1:8、1:16、1:32倍比稀释，各浓度平行制备2管，共10管。5. 5.2供试品阳性对照(PPC)：取上述5个浓度的供试品溶液，加入细菌内毒素工作标准品，使每管内毒素浓度为邕试剂灵敏度的2倍(如：蜜试剂灵敏度为0.125入，则配制的供试品阳性对照管内毒素浓度为0.25入)，各浓度平行制备2管，共10管。6. 5.3阴性对照管(NC)：加入BET水，平行制备2管。7. 5.4阳性对照管(PC)：加入含0.25入内毒素的BET水，平行制备2管。8. 5.5取24支邕试剂，排列标注好,每支加入0.1m1BET水。9. 5.6然后把各组别的试验溶液加入管中，每支0.1m1按浓度高至低依次加入。10

9、. .7将上述试管溶液轻轻混匀后，用医用胶布封口，垂直放入恒温培养箱(37C1C)中，孵育602分钟。11. 5.8若NC组、NPC组平行管均为阴性，PC组平行管均为阳性时，试验有效。12. .9以PPC组的系列平行管均为阳性的反应终点浓度为最大有效稀释倍数(MVD)04. 6.1试验溶液的制备4. 6.1.1根据当批赏试剂的标示灵敏度（）,把细菌内毒素工作标准品用适量BET水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟。以下每步稀释应在旋涡混合器上混合至少30秒。5. 6.1.2【A组】：将供试品的原液用BET水按MVD稀释，平行制备2管。6. 6.1.3【B组】：将细菌内毒素工作标准品用稀释后的供试品

10、溶液（即A组溶液）配制成2人浓度，再以1:2、1:4、1:8倍比稀释（即配制成1人、0.5入、0.25人的浓度），各浓度平行制备4管，共16管。7. 6.1.4【C组】：将细菌内毒素工作标准品用BET水配制成2浓度，再以1：2、1:4、1:8倍比稀释（即配制成1人、05人、0.25人的浓度），各浓度平行制备2管，共8管。8. 6.1.5【D组】：以BET水作为阴性对照，平行制备2管。4.6.2试验过程4.6.2.1取36支宣试剂，按A、B、C、D组别（如图2）排列标注好，每支加入O.IndBET水。图2凝胶法干扰试验NPCOOA组1:800001:4000。组OOOOB原OONCOOD组1:8

11、81:400且组Soc原OO4.6.2.2然后把各组别的试验溶液加入管中，每支加入0.1m1,按浓度高至低依次加入。4.6,2.3将上述试管溶液轻轻混匀后，用医用胶布封口，垂直放入恒温培养箱（37C1C）中，孵育602分钟。4.6.2.4孵育结束后将试管轻轻取出，缓缓倒转180。4.6.2.5若管内形成凝胶，不变形、不从管壁滑落，为阳性；若未形成凝胶，或形成凝胶后变形、从管壁滑落者，为阴性。4. 6.3结果判定4. 6.3.1若A组】、【D组】所有平行管均为阴性，【C组】反应终点浓度的几何平均值在0.52人（包括0.5人和2）,试验有效。5. 6.3.2B组反应终点浓度的几何平均值在0.52（

12、包括0.5和2）时，判定供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。6. 6.4.1若供试品溶液在小于MYD的情况下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。7. 6.4.2若供试品溶液在MVD下有干扰，可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。8. 6.4.3为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。5相关文件5.1中国药典2015年版四部-1143细菌内毒素检查法5. 2细菌内毒素凝胶半定量试验SOP6记录细菌内毒素预试验记录