荧光标记mRNA差异显示技术知识点梳理汇总.docx

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1、荧光标记mRNA差异显示技术mRNA差异显示技术(differentia1disp1ay,DD)是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学领域。在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA(RNAfingerprintingbyarbitrariIyprimedPCR)、GDD(genomicDD)等。本文简要介绍在本试验室荧光标记差异显示技术(f1uorescentDD,FDD)的应用及体会。1 .材料与方法1.1 标本人单核细胞系U937,细胞密度2X1071,分对照组(N)、处理I组(T1)、处理组(T2),N用1

2、640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IFN-104U11PS1Ug1T2用IFN-10U/11PS10g/1分别刺激7h.1.2主要试剂与仪器TR1ZO1试剂(GIBCOBRD、F1uoroDD试剂盒(Genomyx)、Supersript逆转录酶(GIBCOBRD、Amp1iTaqDNA聚合酶(GIBCOBRD、RNase-freeDNaseI(Promega)；Genomyx1R、GenomyxSCnDNATherma1Cyc1er(PerkinE1mer)1.3总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-freeDNaseI(终浓度80000U/1)除去

3、其中污染的DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度1.4mRNA差异显示1.4.1逆转录反应选择锚定引物T7(dT12)AP(anchoredprimers,P),序列为5ACGACTCACTATAGGGCTTTTTMN3,其中M=AGCN=A/G/C/T,以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA1.0g,AP4pmo1,705min,加入50mmo1/1Tris-HC1(pH8.3),75mmo1/1KC1,3mmo1/1MgC12,IOmmo1/1DTT,25mo11,dNTPmix(1I1I1I1),SuperScriptII60UnitS,

4、总反应体系201,425min,5050min,7015min01.4.2荧光标记差异显示PCR选取与逆转录引物序列相同的带荧光物质标记的锚定引物TMR-T7(di2)AP,随机引物(5,Acaatttcacacaggaacgctagttg3),以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20mmo1/1Tris-HC1(pH8.4),50mmo1/1KC1,3.75mmo1/1MgC12,逆转录产物3.01,50mo1/1dNTPmix(1：1：1),0.35mo115-随机引物,0.35mo1/13-锚定引物，Amp1iTaq0.5Units,总反应体系101o反应步骤如下：952m

5、in；9415s,5030s,722min,4个循环；9415s,6030s,722min,个循环；72延伸7min01.4.3分离差异显示片段配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.25mm,大小61X33cm。将PCR产物加401上样缓冲液，95变性后上样。3000V.IOOW.55电泳4.5ho干胶后置于GenomyXSC扫描，用系统所带的ACqUireSCPrOgrain软件分析处理扫描结果。1.4.4回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30UI去离子水中，37水浴30-60min,备用。1.4.5差异条带的再扩增以经上述处理的回收条

6、带为模板，T7启动子22Fier(5,GTAATACGACTCACTATAGGGC3,)、反M13(-48)24-mer(5,AGCGGATAACATTTCACACAGGA3,)为引物，进行再扩增反应：模板2.01,20mmo1/1Tris-HC1(pH8.4),50mmo1/1KC1,1.5mmo1/1MgC12,20mo11dNTPmix(1I1I1I1),0.2Umo1/1T7、0.2mo1/1M13-rAmp1iTaq1.0Units,总反应体系20U1.反应条件同差异显示PCR02.结果2.1总RNA的质量总RNA经DnaseI处理，用1.0%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28S、18

7、S、5S条带，且28S/18S约为2：1(图1),表明RNA完整性好，无降解现象。N、TKT2的0D260/0D280比值分别为192、1.831.98,表明样品纯度高。Fig.1Resu1toftota1RNAonforma1dehyde-agarosege12.2荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变化的差异条带，图2中箭头所示。Fig.2Ana1ysisofgeneexpressionofce11streatedwithIFNand1PSbydifferentia1disp1aytechnique2.3差异条带再扩增取T2中

8、约1.25Kb的条带再扩增，结果见图3.Fig.3Reamp1ificationresu1tofdifferentia11yexpressedbandDNAmarkeris200bp1adder(200bp2kb),1.Okbisarrowed3.讨论基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示技术，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的强弱等优点，一经问世即受到许多领

9、域的重视并得以广泛应用。然而，该技术也存在着一些缺陷，主要表现为：CDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态；所得的CDNA片段通常小于500nt,往往是3-端的非翻译（编码）序列；所得差异片段的假阳性高，可高达85%等。荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极大减少了上述不足。差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总InRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物产生的第一条CDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差示条带在序列胶上易于

10、分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD专用的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达10-15kb（图2）,因较长的CDNA片段容易通过Northernb1ot进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致。通常，再扩增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7（22-mer）与M13-r（24-mer）,此为在锚定引物的5端和随机引物的3端分别增加的序列（本文方法

11、中所列差异显示引物序列的划线部分），这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成CRNA探针，为CDNA片段的直接测序和鉴定（RPA或NOrthern分析）提供了方便。用常规的序列分析胶进行分辨时，较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本操作改用5.6%的PAGE胶（聚丙烯酰胺）,减少胶的厚度（仅250Um）,通过提高电泳的电压（3000V）及温度（55）,可显着提高分辨率。同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物质标记于锚定引物的5,端，可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果

12、，操作周期仅两天。目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理、病理过程相关的未知表达基因的研究，相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。1.4.5差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-1IICr(5,GTAATACGACTCACTATAGGGC3,)、反M13(-48)24-mer(5,AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3,)为引物，进行再扩增反应：模板20u1,20mmo1/1Tris-HC1(pH8.4),50mmo1/1KC1,1.5mmo1/1MgC12,20mo11dNTPmix(1I111),O.2mo1/1

13、T7、0.2mo1/1M13-r,Amp1iTaq1.0UnitS,总反应体系20u1。反应条件同差异显示PCR。2.结果2 .1总RNA的质量总RNA经DnaSeI处理，用10%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28S、18S、5S条带，且28S/18S约为2：1(图1),表明RNA完整性好，无降解现象。N、TkT2的0D260/0D280比值分别为1.92、1.831.98,表明样品纯度高。TjFig.1Resu1toftota1RNAonforma1dehyde-agarosege13 .2荧光标记mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变化

14、的差异条带，图2中箭头所示。Fig.2Ana1ysisofgeneexpressionofce11streatedwithIFNand1PSbydifferentia1disp1aytechnique2.3差异条带再扩增取T2中约125Kb的条带再扩增，结果见图3。Fig.3Reamp1ificationresu1tofdifferentia11yexpressedbandDNAmarkeris200bp1adder(200bp2kb),1.Okbisarrowed3.讨论基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径

15、。1992年报道的真核细胞InRNA差异显示技术，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的强弱等优点，一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而，该技术也存在着一些缺陷，主要表现为：CDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态；所得的CDNA片段通常小于500nt,往往是3-端的非翻译（编码）序列；所得差异片段的假阳性高，可高达85%等。荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极大减少了上述不足。差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或

16、非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD专用的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等,差异片段的长度可达1.0-1.5kb(图2),因较长的CDNA片段容易通过NOrthernb1ot进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意