纤维素降解菌的筛选分析研究 环境工程专业.docx

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1、纤维素降解菌的筛选及特性研究摘要生物堆肥是大部分养殖场固废资源化利用的主要手段，具有投资小、效益高、有机固体废弃物重复资源化利用效率高等优点，但堆肥过程中也存在一些缺陷，如发酵周期长、有臭味、纤维素木质素分解不彻底等。牛粪中含有大量未能消化的纤维素和半纤维素，它们是影响堆肥腐熟进程、决定其堆肥产品质量的关键因素。因此，在牛粪堆肥发酵中选择添加合适的堆肥发酵菌剂和高效纤维素降解菌剂，是解决畜禽粪便堆肥周期长，降解率低等问题的有效途径。本研究采用富集培养及纯培养法从牛粪中将纤维素降解细菌进行分离并分析其降解特性，以期获得一些高效纤维素降解菌。采用水解圈法和3,5-二硝基水杨酸（DNS）法进行菌株筛

2、选与酶学特性研究，结合形态学方法对其初步鉴定，分子生物学方法对其鉴定其种属，共得到降解效果良好的菌株3株，分别命名为DH01、DHO2、DC02,其中DHO1为枯草芽抱杆菌，其纤维素酶活性最高；DH02为苏云金芽泡杆菌，纤维素酶活性次之；DCO2为贝莱斯芽抱杆菌，纤维素酶活性低于前两者。三种菌株均能不同程度分解纤维素，因此，可为牛粪堆肥发酵提供菌种思路，具有重要应用价值。关键词：纤维素降解菌，纤维素酶，分离，酶学特性AbstractBio1ogica1compostingisthemainmethodfortheuti1izationofso1idwasteresourcesinmostfar

3、ms.Ithastheadvantagesof1owinvestment,highefficiency,andhighefficiencyinthereuseoforganicso1idwaste.However,therearea1sosomeshortcomingsinthecompostingprocess,suchas1ongfermentationcyc1esandOdor,incomp1etedecompositionofce11u1oseand1ignin,etc.Cowmanurecontainsa1argeamountofundigestedce11u1oseandhemic

4、e11u1ose,whicharethekeyfactorsthataffectthematurityofcompostanddeterminethequa1ityofthecompostproduct.Therefore,se1ectingandaddingappropriatecompostingfermentationinocu1antsandhigh-efficiencyce11u1osedegradinginocu1antsinthecatt1emanurecompostingfermentationisaneffectivewaytoso1vetheprob1emsof1ongco

5、mpostingcyc1eof1ivestockandpou1trymanureand1owdegradationrate.Inthisstudy,enrichmentcu1tureandpurecu1turemethodswereusedtoiso1atece11u1ose-degradingbacteriafromcowmanureandana1yzetheirdegradationcharacteristics,inordertoobtainsomehigh-efficiencyce11u1ose-degradingbacteria.Usinghydro1ysiscirc1emethod

6、and3,5-dinitrosa1icy1icacid(DNS)methodforstrainscreeningandenzymaticcharacteristicsresearch,combinedwithmorpho1ogica1methodsforpre1iminaryidentification,mo1ecu1arbio1ogica1methodstoidentifyitsspecies,atota1ofThreestrainswithgooddegradationeffectswerenamedDHO1,DH02,andDC02.Amongthem,DHO1isBaci11ussub

7、ti1iswiththehighestce11u1aseactivity;DH02isBaci11usthuringiensis,fo11owedbyce11u1aseactivity;DC02isBaci11usve1ezsBaci11us,ce11u1aseactivityis1owerthantheformertwo.Thethreestrainscandecomposece11u1osetodifferentdegrees,sotheycanprovidestrainideasforcatt1emanurecompostingandfermentation,whichhasimport

8、antapp1icationva1ue.Keywords:ce11u1o1yticbacteria,Ce11u1ase,iso1ation,enzymaticproperties目录1 .引言12 .材料与方法22.1 试验材料22. 1.1样品来源23. 1.2培养基24. 1.3供试溶液25. 1.4供试仪器22.2 试验方法32. 2.1纤维素降解菌的富集33. 2.2纤维素降解菌的初筛34. 2.3纤维素降解菌的复筛及酶活测定错误!未定义书签。5. 2.4纤维素降解菌的滤纸条崩解实验36. 2.5纤维素降解菌的生物学鉴定43.数据与分析43.1 纤维素降解菌的富集、分离与纯化43.2

9、纤维素降解菌的初筛53.3 滤纸崩解实验53.4 维素降解菌的鉴定53 .4.1菌株形态学鉴定64 .4.2纤维素降解菌的分子生物学鉴定63.5纤维素降解菌的酶活测定73. 5.1标准曲线的制作74. 5.2酶活的测定84.结论与展望94.1 结论91 .1.1实验结果94 .1.2讨论94.2 展望9参考文献12谢辞错误!未定义书签。1 .弓I言纤维素是植物细胞壁的重要结构成分，容易与其结合的物质有许多，比如木质素以及果胶等，其结合方式和程度也决定着其资源化利用的能力。纤维素虽然是一种较为廉价的多糖物质，但其广泛地分布于地球上。作为有机物，它们大多都没有得到有效的利用，而是被直接丢弃或者烧毁

10、。现状表明这种做法严重浪费了宝贵的物质资源，从长远发展的角度来看，是不可取的，应尽快提出合理高效利用纤维素的解决方案，对其进行充分利用。纤维素存在于各种有机固体废弃物中，如秸秆、谷壳、废渣和畜禽粪便等。经分析可知，作为直链的纤维素多糖链并不存在分支，但存在糖残基，在糖残基里存在不少羟基,这些羟基会呈一定规律排列，当糖残基和羟基发生反应时，就会有氢键形成，这些氢键能够令多糖链结合得更加紧密，其结构也会更稳固。分析纤维素结构可知，其内部主要可以划分为两个区域，一个是结晶区；一个是无定形区，和前者相比，后者不但疏松度高，而且并不具备较大的分子密度，所以并无结晶结构存在。虽然纤维素可以分为这两个区域,

11、但是两者之间是渐变过渡，而非泾渭分明，其中结晶完善度和两方面存在关联，这两方面首先是纤维部位；其次是纤维素。经分析发现，在无定形区中，其多糖链更容易和各类物质比如化学试剂等接触，所以相较而言，该区域的降解难度更小。通常在植物纤维里，有百分之七十都是微晶纤维素，其余则是无定形纤维素。在这种情况下，纤维素存在较大的降解难度。目前对纤维素的处理方法主要有物理、化学处理法和生物降解法（文少白等，2010）,需要注意的是，物化处理法存在一些缺点，比如需要花费较高成本，反应条件也较为剧烈等等（陈洪章等，2005）o而生物降解法则是添加纤维素高效降解菌到畜禽粪便中进行堆肥发酵，这种方法因经济和有效，已成为当

12、前的研究热点（侯会利等，2015;Bak1rianeta1,2008）o翻阅科研人员在纤维素降解方面的研究成果能够发现，当前有数千种微生物能够对纤维素进行降解，其主要包括三类，首先是细菌，这类细菌一般都为单细胞，和另外两类微生物相比，其体积是最小的，代谢期间，其存在较高的物质交换速率；其次是真菌，这是对纤维素进行降解的主力军，当前许多学者都对真菌选育问题展开了细致研究，其研究对象涉及米曲酶、黑曲酶等；最后是放线菌，此类微生物与真菌相比放线菌具有一些优势如耐各种高温、酸碱度等，因此，在高温条件下，微生物降解纤维素起着主要作用的就是放线菌。随着畜禽养殖业迅速发展，在产生巨大经济效益和社会效益的同时

13、，也会生成许多粪便，产生环保问题，因此当前亟需合适的手段来对粪便进行妥善处理。根据2015年的中央一号文件“加强农业面源污染治理，开展畜禽粪便资源化利用”的污染治理原则，应尽可能的对畜禽粪便进行减量化、无害化、资源化的综合治理，在减轻污染程度的前提下最大程度的实现畜禽粪便的资源化利用（李季，2011）o针对当前情况，本研究从宁夏某牧业养殖场采集牛粪，分离出三株具有纤维素降解功能的芽抱杆菌，对其进行形态学观察，16SrDNA基因序列分析，并对其进行水解圈测定、滤纸条崩解试验，进一步筛选可高效降解纤维素的菌株，以期为缩短牛粪发酵腐熟周期、开发牛粪堆肥菌剂及提高堆肥效率提供优良菌株来源。2 .材料与

14、方法2.1 试验材料2. 1.1样品来源实验样品来自宁夏某农牧业养殖场，采集后放置于4冰箱保存。3. 1.2培养基富集培养基：胰蛋白陈IOg,氯化钠10g,酵母浸膏粉5g,蒸储水IOoOm1,121,IO1kPa条件下灭菌30分钟。分离培养基：牛肉膏3.0g,蛋白陈10g,氯化钠5g,琼脂20g,121,IO1kPa条件下灭菌30分钟。筛选培养基：陵甲基纤维素钠(CMC-Na)20g,KH2PO41.5g,Na2HP042.5g,蛋白陈2.5g,酵母浸膏粉0.5g,琼脂20g,PH调至7,蒸僧水IOOOm1,121,IO1kPa条件下灭菌30分钟。发酵培养基:用于测定酶活。效皮50g,蛋白陈3

15、g,氯化钠5g,(NH4)2SO43g,KH2PO4Ig,MgSo47H2O0.3g,用NaOH饱和溶液调至PH为7.0,IO1kPa灭菌30mino滤纸条崩解培养基：(NHS43g,KH2PO4Ig,MgSO47H2O0.4g,酵母浸膏粉0.1g,pH7.0,IO1kPa灭菌30mio革兰氏碘液：用于纤维素水解圈的测定。KI2.0g,h1.0g,H2300m1oDNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)按照农业部标准DNS试剂配制，柠檬酸缓冲溶液、葡萄糖标准溶液按照QB2583-2003标准配置。4. 1.3供试溶液葡萄糖、磷酸缓冲液、DNS显色剂、NaOH微晶纤维素、CMC-Na5. 1.4供试仪器表2-1纤维素降解菌筛选及酶活测定涉及的主要仪器Tab1e2-1Themainequipmentinvo1vedinthescreeningofce11u1osedegradingbacteriaandthedeterminationofenzymeactivity名称型号厂家洁净工作台HJ-CJ-2D上海苏净实业有限公司续表2-1电热鼓风干燥箱DHG-9203A上海实研电炉有限公司恒温培养箱DHP-9162上海一恒科学仪器有限公司电子恒温水浴锅PK-824上海精宏实验仪器有限公司分析天平JB/T5374-199I梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司PH计pH808香港希玛仪