Expi293 细胞 Stable Pool 构建工艺操作规程.docx

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1、所属类别：稳定细胞株部文件编号：ACR0/QMS/GY/SC1-01文件名称：Expi293细胞StabIePoo1构速工艺操作规程生效日期：2017.2.28编制：张雅慧编写日期：2017.2.25批准人职位：部门主管批准人：批准日期：2017.2.28文件类别：GY页数：3版本号：1.2控制级别：控制文件1目的规范Expi293细胞Stab1ePoo1构建工艺操作规程。2适用范围本实验室Expi293细胞的Stab1ePoo1构建实验。3适用责任稳定细胞株构建组所有成员。4原理外源基因导入到宿主细胞中，既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在,通过长时间的药物筛选，稳定表达抗性基

2、因的细胞得以存活，成为优势细胞群，其子代细胞可在一段时间内高效表达外源基因，从而能较长时间高水平表达目的蛋白。此时构建的细胞株称为Stab1ePOOIo5仪器设备及实验耗材超净工作台、离心机、水浴锅、细胞计数仪、计数板、电动移液器、移液管、无菌离心管、灭菌枪头。6试剂T17PuromycinFeedxCM-190.2%台盼蓝7实验操作7.1 按超净工作台使用与维护标准操作规程正确进行超净工作台的杀菌和使用；7.2 转染操作需严格遵循PE1瞬时转染Exip293F标准操作规程；7.3 转染时细胞密度维持在1.8x1(A2.2x1()6ce11sm1,细胞活率95%以上，转染体积50m1即可满足需

3、要；7.4 转染后20h-30h,进行细胞计数及荧光计数。要求此时细胞活率处于85%以上(若有荧光标记，荧光率需在25%以上)；细胞活率及荧光率如若不符合要求，不做后续操作，从步骤7.1 开始重新转染；7.5 药物筛选过程7.5.1 配置培养基：吸取40m1-50m1T17至无菌摇瓶中，筛选药物为PUromyCin,一般浓度为30ugm1-60ugm1（添加体积按照培养总体积计算），培养添加物为FeedX,添加体积为新鲜培养基总体积的5%,如若细胞有成团迹象，可添加IXCM-19（母液浓度一般为I（X）X）。配置好培养基后，放入37C水浴锅中进行温浴；7.5.2 药物筛选以1oX1O6cesm

4、1稀释药筛，依照细胞密度计算所需细胞液体积；7.5.3 离心操作：离心机转速设置为750-800rmin,离心5min；7.5.4 重悬操作：取IOm1培养基重悬细胞沉淀至温浴好的培养基中；7.5.5 隔天进行计数及离心换液操作。具体步骤同7.5.1&7.5.2&7.5.3&7.5.4。药物筛选第6天左右，细胞活率约为20%-60%（药物筛选活率最低点），活率低点受多种因素影响。在药筛期间密切观察细胞状态，药物筛选第10天左右，细胞活率缓慢恢复至60%-70%,细胞密度轻微增长，此时依然按1x1（）6ce11sm1进行稀释离心换液，通过计算，取一定体积细胞液进行离心换液。药物筛选第18天左右，

5、细胞状态恢复正常。细胞倍增时间为2530h,活率95%以上。7.6 细胞库的冻存及初步表达量检测：细胞状态恢复后，进行5支一级库的冻存，同时进行SF250-50m1Batch的培养以进行初步表达量检测。培养时间为7/0天，期间进行2-4次5%FeedX的补料，若细胞成团，可添加IXCMj9（母液浓度一般为I（X）X培养中后期进行35个样品的留样，送检QC。初步表达量评价后，进行10支二级库的冻存。7.7 SC1部门生产验证：初步表达量结果进行初审后，若达到项目目标，视表达量及具体要求而定，进行200m1或者21-1200m1的大体积生产验证培养，传递至纯化进行表达量的较准确判定及后续部门蛋白质

6、量检测。培养时间为10天左右，期间进行24次5%FeedX的补料，若细胞成团，可添加一次或多次IXCM-19（母液浓度一般为IoOX）。培养中后期进行35个样品的留样送检QC。21-800m1&21-1200m1的具体培养参数如下：80Om1M养系统通气量(m1min)转速(rmin)前W(0.510*Ekm1接入)203-32O中期(2XIO6CeIWm1)30340-360后期(5XIO6Ce1Wm1)SO360-380120OE1培养系统通气量(m1min)转速(rmin)前WHo.5IO6CdIsZm1It入)30310-330M,WJ(2106ce11sm1)40340360uW(5

7、106ce11sm1)60370-48注意事项：8.1 离心换液吸取细胞沉淀时必须轻柔操作；8.2 项目进行过程中转染后、药筛过程中、药筛结束时、细胞建库前至少进行4次无菌验证操作；8.3 除细胞计数外所有实验过程要求严格无菌操作，一旦发现污染必须及时处理；9相关文件SC1细胞转染记录SC1悬浮细胞实验记录SC1工作液配制记录SC1质量检测报告21简易系统检测记录SC1无菌验证操作记录CROQMSGYSC1OI-RO1ACR0/QMS/GY/SC101-R02ACR0/QMS/GY/SC101-R03ACRO/QMS/GY/SC1O1-R04ACR0/QMS/GY/SC101-R05ACRO/QMS/GY/SC1O1-R06日期更新内容更新后版本号更新人2016.5.1表头格式修改1.1王薇2017.2.25公司1ogo更新及内容修改1.2张雅慧日期:日期：编制人:批准人: