Gallios流式细胞仪操作规程.docx

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1、高端流式细胞仪Ga11ios操作规程BeckmanCou1ter医学院中心实验室2023年12月Ga11ios操作规程注意：重新开机前先确认是否已经关机30分钟以上，以保护激光器。一、开机前检查1 .检查鞘液桶并确认：外置鞘液桶是否充足，需充满1/3以上鞘液，鞘液为加有万分之一NaN2的超纯水。旋紧外置和内置鞘液桶盖子，管路与桶盖连接，无扭曲。2 .检察废液桶并确认：及时清空废液桶，可酌情在废液桶内加入少量次氯酸钠原液，旋紧废液桶盖子，管路与桶盖连接，无扭曲。3 .检查清洗液桶，确认加满清洗液。二、开机1 .开启液流车电源箱开关，启动计算机。2 .在出现的WindoW窗口对话框中输入用户名（a

2、dminstra1or）和密码（password）3 .点击桌面,此时405nm、488nm、635nm激光器自动开启，如实验需要56Inm激光器，可在仪器后方打开该激光器的电源。点击函依SOftware（工作站）图标，在用户登录对话框中，选择登陆的用户名SerViCeI,输入密码SerViCe5（密码会定期更换）,点击“Next”。4 .下一窗口，点击“Connect”，启动流式细胞仪。注意：如流式细胞仪重新启动后，再次关机必须等待30分钟以上，以保护激光器。5 .打开电源箱门，做如下检查：AIRFI1TER,VACUUM1TER必需干燥无水；WATERTRAP液体不能超过1/3；VACUU

3、MTRAP液体不能超过1/4；检查SYSTEMVACUUM表，确认在-17-30in.Hg;检查SYSTEMPRESURE表，确认在2832PSI之间。注意：如SYSTEMPRESURE表计数不在上述范围内，拉出PRESUREADJUSTER钮，调节压力至302,将按钮复位。（第5条一般由仪器管理员每天检查）6 .激光预热1（M5分钟，观察流式细胞仪主机前的指示面板，“STATUS”指示灯变为绿色如图标示，且软件提示“AwaitingSamp1e，执行Prime叵,排除管路气泡后，既可以开始检测标本。三、检测标本以人双色淋巴细胞亚群为例，介绍Ga11ios流式细胞仪检测双色样本流程。1 .实验

4、试剂：单克隆荧光抗体：ISotyPeCOnt（IgG1-FITCZIgG1-PE）；CD3-FITC/CD19-PE;CD3-FITCCD4-PE;SCD3-FITC/CD8-PE;CD3-FITC/CD16+56-PEo红细胞裂解液:即用型，室温保存（18-25C）；0.0IMPBS；Immunotro1质控血或者EDTA抗凝血。2 .样本制备：A取5支流式试管，编号为1、2、3、4、5,分别将IOO1抗凝全血或ImmUno1质控血加入1-5号试管中，小心不要将血挂在试管内壁上；B在各管中依次加入20的IgGI-FITC/IgGI-PE、CD3-FITC/CD19-PE、CD3-FITCCD

5、4-PECD3-FITCCD8-PE.CD3-FITC/CD16+56-PE,涡旋混匀后，室温避光孵育20分钟；C取出试管，每管加入500U1红细胞裂解液OP1i1ySeC,涡旋混匀，室温避光10分钟；300g（约120OrPm）离心5min,弃去上清液；D每管加入2m1的PBS,涡旋混匀，30Og离心5min,弃去上清液；E每管加入0.5m1PBS混匀，4C避光Ih内上机检测；若不能及时上机，加入05m1含1-2%多聚甲醛的PBS溶液，置于4冰箱保存，24h内上机检测。3 .建立双色方案：A选择“Fi1e”“NewNewProtoco1,B选择参数：点击工具栏中的Cytome1erContr

6、o1|键,选择Acq.Seiup”选项卡，点击“Parameters”进入参数选择对话框，依实验选择所需的参数，点击“OK”，为方案选择保存路径，命名为“2C1ymISOtyPe.pro”本实验所选参数为FSINT1IN;SS-INT-1in5F11-INT-1og;F11-INT-1ogeC建立该实验方案所需图形：本实验需要二个图（请同学们思考：不同的实验目的需要几幅数据显示图，怎样组合双参数散点图）键，X轴选择“SSINT1IN:SSINTSS/FS双参数点图：单击工具栏中的（Cok）rDoiPIoD1IN”，Y轴参数选择44FSINT1IN:FSINT1INw,Ga1e参数选择44Ung

7、atedw，如需在图形中直接显示细胞相对百分含量，可在“Show%OnPIot前的方框中打“J”，如下图。单击OKo(Po1ygona1Region)键，在FS/SS点图中画多边形门A,用来圈定淋巴细胞。UngatedSSINT1INZFSINT.Rj叵|区IF11/F2双参数散点图：单击工具栏中的(CoIorDoIP1O1)键，X轴参数选择“F11INTF111OG”，Y轴参数选择“F12INTF1210G”,GaIe参数选择“A”,如下图左，单击OK。在工具栏中选择键H,在F11/F12点图中第一个对数格处画十字象限，如下图右。将鼠标移至该图左下角，出现“”时，单击鼠标左键，显示统计。单击

8、工具栏图标，可编辑统计项，依据本实验所需数据要求在弹出的窗口中选择NUmbe、%Gated.X-Mean.Y-Mean,并在“Repor1Op1ions下面的MeanCa1cu1ationMaIho在弹出的对话框中选择“Se1ectParametertoedit栏中的F11INT1OG”，在对应的“Stain”栏中输入“CD3-FITC”；选择rtF12INT1OGw,在对应的“Stain”栏中输入“CD16+5&PE，单击“OK”；M单击菜单栏“Fi1e”“SaveProtoco1AS”，在弹出的对话框中输入“2C1ymCD3-16+56”，单击“Save”。4 .建立实验组合（Pa1ICD

9、A单击菜单栏“Fi1e”-*“New”一“NewPane1”，在弹出的对话框中“Pane1Name”栏中输入组合名称“2C1ym”，在“N。OfTeSt”栏中输入“5”（表示为5个检测管做组合），在Expor11heresu1tsof1hispane1iotheReportGenerator单击Nex1”；B在新弹出的窗口设置第1管检测选项：选择Usep1otsandgatsfromprotoco1”，在其下拉方案中选择u2C1ymisotype.PROM，选择UseInstrumentSettingsw和wUseRegionsfromthisprotoco1,点击“Next”;C在新弹出的窗

10、口设置第2管检测选项：选择Usep1otsandgatsfromprotoco,在其下拉方案中选择2C1ymCD3-19.PRO，选择Useinstrumentsettingsfromprevioustestn和“UseRegionsfromthisprotoco1w，点击Next;D其余3管分别在下拉方案中选择“2C1ymCD3-4.PRO、“2C1ymCD3-8.PRO、“2C1ymCD3-16+56.PRO”，其余的选项不变，最后点击“Finish”Test1of5Protoco1Settings1Usep1otsandgatesfromprevioustestCUsep1otsandg

11、atesfromprotoco112C1ymIcotype.PROR/USeInstrumentSettingsRegionSettings6Useregionsfromprotoco1Carryregionsfrompreviousprotoco1CUseregionsfromthisprotoco1:5.数据获取条件设定:A在Fi1e”-AWorkspacePreferences,弹出对话框中选“1MDFi1eName”选项卡,选择“Samp1eID1、“Samp1eID2、“Y2KDate、“TagNumber和“Starteachpane1atOO1n,点击“OK”B点击View”-A

12、CustomizeVVork1istCo1umns,在弹出对话框中选择选择Pan1、“Protoco1、4wCytocytingsw“TubID、Carouse1No、1oca1ion”、“Samp1eID1”、“Samp1eID2”，点击“OK”C获取停止条件设定：选择工具栏中的“圆”在Acquisi1ionSeiup”选项卡中完成设置获取时间：“1imitS”中点击“SeiTimes”，在弹出的对话框中的将“Acquisi1ionTime(s)”1M由引IIF1ieF110OfF2501.0J设为300；wE1apsedTime(s)”设为500SetAcquisition/E1apsedTimeAcquisitionTmemustbe1essthanorequa1toE1apsedTime.IFnoE1apsedTimeisspecifiedJhenAcquisitionTimewibeused.AcquisitionTime(s)