国家自然基金申请书写作：核酸检测篇9-Digital PCR.docx

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1、编号：2-9主题：digita1PCR概述：Digita1PCR(dPCR)即数字PCR,它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR,数字PCR可以直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。由于数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠Rea1-timePCR的Ct值不能很好分辨的应用领域，例如：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。目的：对DNA分子的个数进行绝对定量

2、。原理：其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。步骤：1 .分离并纯化基因组DNA;2 .计划数字PCR实验，确定样品的最佳稀释度，以获得数字PCR答案;3 .上样，将DNA样品与TqMAssay以及OpenArray数字PCR预混液上样至IJOpenArray384孑1板；4彳盾环和成像,利用OpenArrayAccuFiII系统将反应上样到OpenArray平板。将C)P6AQy平板插入C)PenArToy箱中，装满浸液，并用封箱胶水密封。利用OpenArray实时定量PCR系统开展读取。5.快速轻松地获取和分析数据。流程图：DNAStep1Di1utetoT12copy/we11pcrOOOOOOooooooooooooIAddF1uorescentProbesSteP2IF1uorometryoooooooocNoPCRProductWi1dTypePCRProductMutantPCRProductCF1、MB-RedMB-Green7ZH-Quer1edCodons