2023基于质谱技术检测蛋白质的临床应用进展.docx

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1、2023基于质谱技术检测蛋白质的临床应用进展摘要基于质谱技术的蛋白质分析已成为一种强大的临床实验室工具，相较于传统方法，它提供了更可靠的评估途径，为疾病的诊断和治疗带来更多益处。针对靶向蛋白的定量分析已广泛应用于胰岛素样生长因子1、甲状腺球蛋白和单克隆抗体药物等领域。同时，非靶向质谱蛋白分析也取得重大进展,如淀粉样变性、单克隆免疫球蛋白疾病和膜性肾病的诊断。高分辨质谱技术使得致病蛋白得以鉴定和鉴别，同时揭示了参与疾病发病和进展的新蛋白质。因此，临床诊断和疾病鉴别得到改进，对这些疾病的认识也得到提局I。质谱技术在过去的二十多年中在临床诊断领域取得了显著发展，其如今在许多医院和第三方医学实验室已成

2、为了一种常用的检测方法。这一技术在小分子的定量和定性分析方面展现出了出色的特异性和灵敏度，尤其在药物浓度监测（如抗真菌药物、免疫抑制剂、肿瘤药物和精神药物）、激素检测（如肾上腺激素、性激素等维生素检测、代谢疾病检测（如有机酸、氨基酸、酰基肉碱）以及毒理检测等多个项目上,质谱检测已成为参考方法并得到广泛的临床开展。相较于质谱技术在小分子分析方面的应用，具在蛋白质分析上的临床应用仍存在着许多未开发的潜力。早期，质谱在蛋白质分析方面主要应用于研究型实验室，如生物标志物的发现、结构鉴定和翻译后修饰研究。这些研究对仪器的灵敏度和分辨率要求极高，因此通常需要纳流液相和高分辨率质谱组合。然而，该技术组合实验

3、过程复杂且耗时，对于临床实验室的常规操作并不理想。在2000年初，随着质谱技术开始大量应用于临床小分子检测，基于质谱技术的蛋白质检测项目也逐步得到研发并在临床实践中使用。经过多年的发展，尽管仍面临各方面的局限，但该领域已取得了显著进展并展示出巨大的潜力。事实上，我们正看到越来越多的临床实验室开始尝试和开展这项技术，并在此过程中逐步改进和优化检测流程。值得注意的是，国内的临床质谱发展相对于国外较晚，特别在开展蛋白类标志物检测方面才刚刚起步。因此，应该掌握质谱蛋白质分析在北美地区临床实践中的应用现状和进展，为国内临床蛋白质谱技术应用的发展提供一定的实用性参考意见。我们能够从临床检验从业人员的角度，

4、结合临床需求、技术实现和成熟度等因素，帮助更多临床检验同行了解这个领域的现状和趋势，从而推动国内质谱技术在临床蛋白质分析中的更广泛应用。一、靶向蛋白质定量分析在临床实验室中，蛋白质定量分析通常依赖于自动化的免疫方法，其高通量和快速周转时间的特性满足了绝大部分临床需求。然而，针对部分蛋白质定量,免疫方法难以提供准确可靠的结果。因此，采用质谱技术进行特异性和准确性更强的靶向蛋白质定量分析在临床上具有重要意义。这类分析涉及样品前处理和液相色谱分离，并可以使用不同分辨率的质谱仪，选择对完整的蛋白质进行定量，或者将蛋白质酶解为多肽，通过测量特定的肽段进行定量。前处理方法通常包括蛋白分离、免疫富集、蛋白酶

5、解以及固相萃取等步骤，可根据蛋白质或多肽大小和丰度来优化前处理方法。对完整蛋白质进行定量通常需使用高分辨率四极杆-飞行时间质谱或轨道阱质谱。对于通过定量签名肽段测量蛋白质的方法,签名肽长度通常在825个氨基酸左右，可使用三重四极杆质谱的多反应监测模式或上述高分辨率质谱的并行反应监测模式进行检测。目前，质谱蛋白质定量方法在临床实验室的应用已日趋成熟，成功使用于多个检测项目。接下来，我们将从临床必要性、实用性、与传统方法的对比优势，以及技术要点等方面，介绍几个在北美较为广泛应用的质谱蛋白质定量方法。（一）胰岛素样生长因子-1（insu1in-1ikegrowthfactor1,IGF-I）IGF-

6、1是一种具有调节生长激素作用的小分子蛋白，对评估儿童和青少年生长发育及诊断成人生长因子紊乱至关重要。目前，临床实验室主要采用免疫方法检测IGF-1,但各方法间存在较大差异，使得测量的标准化程度低11使用质谱定量IGF-I有助于提高结果的准确性，避免免疫方法中抗体交叉反应和特异性限制的问题。定量方法可以通过自下而上或自上而下的方式进行20在采用自下而上方法时，通常需要首先进行免疫亲和富集，例如使用基于滴管头的微规模样品纯化技术，之后对纯化的微量蛋白进行胰蛋白酶酶切,再通过液相色谱-串联质谱分离和检测选择的酶切肽段31然而，由于IGF-1相对分子质量较小（约7600Da）,对完整蛋白进行直接定量更

7、为普遍，从而避免样品处理中酶切带来的差异。这种方法可使用同位素标记的IGF-K如15N-IGF-1）或IGF-I合成类似物（如1R3-IGF-1）作为内标，通过酸化乙醇将IGF-I与其结合蛋白分离并实现较大蛋白质的沉淀，然后使用中和、冷沉淀等技术分离更多蛋白质。分离出的上清液可进一步固相萃取，再经超高效液相色谱进行有机相梯度分离4,5O结合四极杆-飞行时间质谱或轨道阱质谱等高分辨率质谱仪器，以全扫描模式，将IGF-1的7+荷质比（m/z1093.5209）作为定量离子来提取离子色谱图。紧邻该定量离子的同位素峰（m/z1093.38和1093.65）可被用作确认离子，通过其相对丰度来监测其洗脱干

8、扰物的存在。IGF-1完整蛋白质定量是第一个常规应用于临床实践的蛋白质定量方法，通常在不到10min的时间内完成一次液相质谱检测。但需要注意，IGF-I基因的多态性可能造成蛋白质量的变化，从而导致错过目标蛋白的检测。因此，质谱的IGF-1定量方法应尽量覆盖已知的变异体，包括根据已知的DNA单核甘酸多态性数据库建立可同时监测野生体以及多个变异体的方法6,7,8o（二）甲状腺球蛋白（Tg）另一个进入临床日常应用的质谱蛋白定量方法是甲状腺球蛋白（Tg）定量。Tg作为甲状腺素的前体分子，由甲状腺合成并分泌，对于甲状腺癌的检测和治疗跟踪具有重要意义。在对分化型甲状腺癌患者进行完全的甲状腺切除后,血清Tg

9、水平可提供关于患者肿瘤残余、复发或转移的重要信息9,10o传统的Tg检测采用免疫方法，由于相当比例的甲状腺癌患者体内存在甲状腺球蛋白自身抗体，可能导致Tg的假阳性或假阴性结果，因此质谱方法成为一种具有更高特异性的替代选择11,12o为了灵敏地监测甲状腺癌复发检测方法需要在1ng/m1的浓度水平上准确测量Tg。质谱方法可通过一步或多步免疫富集来提高灵敏度。首先利用蛋白沉淀去除无关蛋白，并通过Tg抗体富集目标蛋白。在添加内标之后，对富集蛋白进行变性、还原和胰蛋白酶消化，再通过抗肽抗体来免疫纯化所选择的签名肽段，最后由液相色谱-串联质谱分离和分析签名肽段。目前，基于质谱的方法已成为测量Tg的金标准在

10、北美多个临床实验室得到日常使用。尽管质谱对Tg测量的灵敏度总体不如放射免疫法，但通过免疫富集,目前的质谱方法可达到0.5ng/m1及以下的灵敏度13,14o然而，质谱蛋白定量仍面临其他挑战，如所选择的签名肽段的单点多态性以及蛋白质的翻译后修饰导致选择的多肽片段发生裂解或磷酸化，导致在质谱测定中漏掉该多肽。在笔者的临床工作中，出现过通过影像扫描和放射免疫法都检测到甲状腺癌复发，然而基于质谱测量的Tg仍是阴性的情况。因此,对于每个目标蛋白同时测量多个多肽片段有助于避免报告偏低或假阴性的Tg结果。胰蛋白酶消化Tg会产生超过400个肽段，其中有3个被认为适用于定量测量Tg13115o（三）其他蛋白定量

11、及技术难点质谱蛋白定量技术已实现的临床应用还包括对血管紧张素161多种载脂蛋白（apo1ipoprotein,apo）和单克隆抗体药物（如英夫利昔单抗和阿达木单抗）等的定量检测。以英夫利昔单抗药物为例，主动监测药物浓度可以显著改善药物的安全性和有效性17o自2015年以来，针对英夫利昔浓度测量的质谱方法开始在临床实践中得到应用。多数方法对该单抗药物酶切后的签名肽进行定量18;也有方法为避免酶切的不一致性，仅分离免疫球蛋白上的轻链，对完整轻链进行定量19o此外，由于apo对脂蛋白代谢起到关键作用，测量它们可以用于改进基于血脂的心血管疾病风险预测。除了apoA-Ir叩C)B和apo(a)z心血管疾

12、病风险也与apoC-xapoC-I和叩OE的血清水平密切相关。免疫测定无法用于大多数apo并且难以同时检测，近年来，临床实验室使用液相色谱-串联质谱定量签名肽段的方法实现了同时、高度特异性地定量多种apo20,21,22o2023年zIFCC质谱检测apo工作组已经为7种相关血清apo的国际标准化制定了技术基础，并已开发了多种叩。质谱测量的参考方法231尽管质谱蛋白定量技术日趋成熟，但其在临床实验室环境中的建立和实现日常开展仍面临一些技术挑战。首先，酶切方法的建立需要优化许多实验条件，如温度、溶剂、时间等，以确保所有签名肽段的完全且一致的酶切。其次，签名肽的选择需要避免可能发生化学修饰的不稳定

13、氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)以及含有翻译后修饰或基因变异导致氨基酸变化的肽段。此外，为了提高定量的准确性，每个蛋白应至少监测2个肽段每个肽段至少选择2个或最好3个多反应监测通道。这些都增加了项目建立的复杂性和挑战性。加上样品的收集、保存、免疫富集、内标选择等因素，以及质谱性能的不稳定性，这些都可能影响日常结果的准确性。因此，实验室应遵循严密的方法建立和验证要求，进行定期的仪器维护和校准，采取标准化操作流程，实施内部和外部的质控程序,以提高实验的精密度和准确性。尽管如此，目前的质谱蛋白定量方法仍存在不可忽略的实验室内及实验室间差异220目前，国内还没有针对临床蛋白质质

14、谱方法建立的标准指南，临床实验室人员可以参考美国临床和实验室标准研究院于2023年发布的C64指南。该指南为开发和验证临床质谱蛋白定量方法提供了系统性的具体要求。二、非靶向蛋白分析微生物鉴定是非靶向蛋白分析在临床中的一个应用，其利用核糖体蛋白的特异性并分析质谱图谱来鉴定不同菌株240这一方法结合了成熟的基质辅助激光解吸-离子化飞行时间质谱(MA1DI-TOf)技术和不断更新的菌株数据库,使得微生物蛋白指纹图谱与数据库进行匹配,实现了微生物鉴定临床流程的重大变革。血红蛋白变体的检测是一种类似的技术应用，这个领域已经进行了多年的实验尝试，并显示出一定的可靠性和实用性。但是，与现行的检测方法相比，其

15、在周转时间、准确性和操作性上尚未展现出明显优势，因此仍主要作为个别病例分析的研究手段。另一方面，目前在北美，其他基于非靶向蛋白分析的临床项目仅集中在大型第三方实验室中开展，这些项目主要依赖于高分辨质谱仪以及数据依赖性或数据独立性获取的扫描方式，旨在检测特定种类的蛋白质。(-)淀粉样变性分型检测其中一个成功在临床实践中转化为日常应用的方法是淀粉样变性分型。这种方法自2010年前后开始被用于临床检验，如今已被公认为该领域的金标准方法。淀粉样变性是由蛋白质和肽在不同组织和器官内的病理聚集和沉积引起，尤其常见于肾脏、心脏、胃肠道和神经系统24o对不同来源的淀粉样蛋白进行准确诊断至关重要，因为这可以为不

16、同的致病蛋白制定出针对性的治疗策略，例如，遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性可以使用基因治疗；免疫球蛋白轻链淀粉样变性可使用多发性骨髓瘤类似治疗以及干细胞移植治疗；血清淀粉样蛋白A淀粉样变性可以使用免疫抑制剂治疗25,261传统的淀粉样变性分型检测方法是使用免疫组织化学对活检样本进行特殊染色，该方法存在诸多技术限制，比如福尔马林固定后蛋白质交联过程中不可避免的表位损失，抗体检测的特异性和灵敏度不足，且仅染色最常见的3个蛋白，无法鉴定其他多数的致病蛋白270因此，结合激光显微切割和质谱技术的新方法被引入到临床实践中。该技术首先使用激光显微切割对刚果红染色后识别出的阳性区域进行切割，然后从切割组织中提取蛋白质，酶切蛋白，再通过nano1C-HRMS分析多肽混合物。获取的结果通过匹配2-3个不同的数据库（如SequestX!Tandem和Mascot）,推导出胰蛋白酶切割的肽段和样品中蛋白。为确保结果的可靠,通常只有在检测出至少一个置信度高的独特肽