T_CSCB 0004-2022 人神经干细胞.docx

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1、ICS07.080CCSA40体标准T/CSCB000420232023-08-30发布人神经干细Humanneura1stemce11中国细胞生物学学会发中国标准出版社出2023-10-31实施布版目次前言I1范围12规范性引用文件13术语、定义和缩略语14技术要求25检验方法26检验规则47使用说明48标签49包装、储存及运输510废弃物处理5附录A（规范性）细胞存活率检测细胞计数法6附录B（规范性）细胞标志蛋白检测免疫荧光染色计数法（仲裁法）7附录C（规范性）细胞标志蛋白检测流式细胞术9-xx.刖本文件按照GBT1.12023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。

2、请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国细胞生物学学会标准工作委员会提出。本文件由中国细胞生物学学会归口。本文件起草单位：中国科学院动物研究所、北京干细胞与再生医学研究院、国家干细胞资源库、中国干细胞与再生医学协同创新平台、北京工商大学、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心、南京医科大学、北京泽辉辰星生物科技有限公司、中国标准化研究院、中国合格评定国家认可中心、中山大学、昆明理工大学、华中科技大学同济医学院附属同济医院、北京协和医院、郑州大学第一附属医院、首都医科大学附属北京天坛医院、浙江霍德生物工程有限公司、中国医学科学院血液学研究所血液病医院

3、、中国计量科学研究院、中国科学院微生物研究所。本文件主要起草人：王昱凯、赵同标、周琪、胡宝洋、马爱进、郝捷、陈跃军、刘长梅、刘妍、张愚、王长林、翟培军、项鹏、李天晴、唐铁山、陈红、包新杰、王燕琳、贺文艳、范靖、滕兆乾、王柳、周家喜、傅博强、付钮、冯琳、曹佳妮、梁灵敏、于娟、王磊。人神经干细胞1礁本文件规定了人神经干细胞的技术要求、检验方法、检验规则、使用说明、标签、包装、储存、运输和废弃物处理等要求。本文件适用于原代及多能干细胞分化来源的人神经干细胞的质量控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件

4、；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。WS213丙型肝炎诊断WS273梅毒诊断WS293艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准T/CSCB00012023干细胞通用要求中华人民共和国药典(2023年版)全国临床检验操作规程3梓、皿Sm语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1人神经干细胞hunanneura1stemce1I人中枢神经系统中具有自我更新能力、同时具有分化成星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞潜能的细胞。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。EBV:人类疱疹病毒(EPStein-BarrVirus)HBV:乙型肝炎病毒(HCPatitiSBVir

5、us)HCMV:人巨细胞病毒(HUnIanCytomega1ovirus)HCV:丙型肝炎病毒(HePatitiSCVirus)HIV:人类免疫缺陷病毒(HUnIanImmunodeficiencyVirus)HT1V:人类嗜T细胞病毒(HUnIanT-IymphotropicVirus)STR:短串联重复序列(ShortTandemRepeat)TP:梅毒螺旋体(TrePonenIaPa11idum)4技术要求41原材料礴料4.1.1原材料的获取应符合相关要求。4.1.2应符合T/CSCBOoOI-2023要求。4.1.3原材料应不携带HIV、HBVsHcV、Hr1V、EBV、HGMV、TP

6、o4.2关键质M性4.21细胞形态细胞单层贴壁生长时，细胞核不明显，细胞体呈单层或者多层柱状(镜下观察)3D培养时，可自发形成致密透亮的球形。422染色体核型正常核型应为46,XX或46,XY423细胞存活率未冻存280%,冻存复苏后260%。4.2.4细胞标志蛋白NESTINffi性率280.0%,SOX1、S0X2双性阳率270.0%4.25分化细胞特征经培养后可分化为神经元和胶质细胞(星形胶质细胞和/或少突胶质细胞)。细胞形态：含有胞体呈多极或双极，有较长的神经突起的神经元。细胞标志蛋白：可分化为含有GFAP和/或-S1OOg阳性星形胶质细胞、MAP2和/或NeUN和/或TUJ1阳性神经

7、元、PDGFRa和/或A2B5和/或04阳性少突胶质细胞。4.26微生物真菌、细菌、支原体、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类嗜T细胞病毒、人类庖疹病毒、人巨细胞病毒、梅毒螺旋体应为阴性。435M4. 3.1冻存、复苏等过程控制应符合T/CSCBOoO1-2023要求。5. 3.2细胞STR检测结果应与供体细胞保持一致。5检验方法5.1 细胞形态二维培养条件下，用明视场细胞显微镜进行观察。5.2 Sft!按照中华人民共和国药典（2023年版）中的“染色体检查”检验。5.3 细胞存活率按照附录A的方法检验。5.4 细胞标志蛋白按照附录B或附录C的方法检验。5.5 微生物5.5.1

8、 真菌按照中华人民共和国药典（2023年版）中“1101无菌检查法”检测。5.5.2 婶按照中华人民共和国药典（2023年版）中“1101无菌检查法”检测。5.5.3 支原体按照中华人民共和国药典（2023年版）中“3301支原体检查法”检测。5.5.4 HIV按照WS293核酸法检验。5.5.5 HBV按照全国临床检验操作规程核酸法检验。5.5.6 HCV按照WS213核酸法检验。5.5.7 HT1V按照全国临床检验操作规程核酸法检验。5.5.8 EBV按照全国临床检验操作规程核酸法检验。5.5.9 HCMV按照全国临床检雌作规程核酸法检验。5.5.10 TP按照WS273核酸法检验。5.6

9、 分化能力湖按照附录B或附录C的方法检验。6检验规则6J抽样方法和数611在同一个生产周期中，同一生产线、同一来源、同一代次、同一方法制备出来的产品为一批。6.1.2在同一批的产品中随机抽取3个最小包装单元6.2出厂检验6.21 每批产品应进行出广检验，并附检验报告。622电厂检验项目应包括4.2规定的所有项目。63复核检验根据需要，应由专业细胞检验机构实验室进行复核检验。6.22 定规则6.22.1 厂检验项目全部符合4.2规定，判为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。6.22.2 核检验项目全部符合4.2规定，判为合格品；有1项及以上不符合本文件规定，则判为不合格品。7例

10、觥应至少包括以下内容：a）名称；b）代次；c）数量；d）生产日期；e）生产批号；f）生产组织；g）储存条件；h）运输条件；i）联系方式；j）使用方法；k）执行标准号；1）生产地址；m）邮政编码；n）注意事项。注：根据用户需求，提供内毒素结果。8标签应至少包括以下内容：a）名称；b）代次；c）数量；d）生产批号e）生产组织；D生产日期。9包装、储磷9.1 包装应选择对人神经干细胞关键质量属性无影响的材料和容器。9.2 储存9.2.1 应符合T/CSCB0001-2023要求。9.2.2 应在低于T30C液氮环境下储存。9.3 运输9.3.1 应符合T/CSCBOOO12023要求。9. 3.2应

11、在干冰或低于一130C条件下运输。10废弃物处理10. 1人神经干细胞生产和检测过程中产生的废弃物应建立废弃物细胞管理档案，严格执行管理规范并详细记录。11. 2人神经干细胞研究和生产中不合格的细胞、剩余废弃的细胞或捐赠物，应进行合法、妥善并符合伦理的处理。附录A(规范性)细胞存活率检测细胞计数法.1仪器和设备AJJ显微镜。A.1.2血球计数板。A.2试剂除特别说明外，所有试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。A.2.1磷酸盐缓冲液：PH为7.4。A.2.2台盼蓝染液。A.3检测步骤A.3.1细胞悬液制备收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液(A.2.1)配制细胞悬液，稀释至合适的浓度。每个Imm2的

12、方格中的细胞的数量应为20个50个细胞。如果高于200个细胞，则需要进行稀释。A.3.2细胞染色按1:1的体积比将台盼蓝染液(A.2.2)与细胞悬液(A.3.1)混合均匀。A.3.3细胞计数将盖玻片盖在血球计数板(A.1.2)计数槽上，取10II1混合液(A.3.2)滴在侧计数室的盖玻片边缘，另取101混合液，滴在另一侧计数室的盖玻片边缘，使混合液充满盖玻片和计数板之间，静置30s,将计数板置显微镜(A1.1)下对被染色的细胞和细胞总数分别进行计数。对16X25规格的计数室，按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个Imm2的中格(即100个小格)计数。对25X16规格的计数室，按对角线位，取左

13、上、右上、左下、右下和中央5个中格(即80个小格)计数。当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和左线上的细胞(或只计数下方和右方线上的细胞)。A.4计算与分析细胞存活率按公式(A.1)进行计算。S=(M-D)M100%(A.1)式中：S细胞存活率；M细胞总数；D染色的细胞数。细胞存活率为2个样品的平均值。计算两次计数活细胞比率结果的平均值，记为细胞平均存活率。A.5精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。附录B(规范性)细胞标志蛋白检测免疫荧光染色计数法(仲裁法)1.1 仪器和设备激光共聚焦显微镜。1.2 试剂8. 2.1PBSo9. 2.24

14、%多聚甲醛(PFA)8.2.3 Triton-X1OOo8.2.4 牛血清白蛋白BSAc1.1.2 2.5HoeChSt33342。1.1.6 防淬灭剂。1.1.7 无色指甲油或封片剂。1.1.8 抗体。1.1.9 按相应要求配制检测所需的液体：封闭液、抗体稀释液。8.3 样品保存固定后的样晶、PBS、4%多聚甲醛，HoeChS2332于2CC保存牛血清蛋白、防淬灭剂于-20保存。Trito-Xo,无色指甲旧或封剂室温保在。抗体按说明书保有8.4 检测步聚8.4.1 样品准备和固定将无菌玻璃片放在细胞培养皿底部中央，接种细胞。待细胞生长到合适密度时，弃掉培养液，用4%PFA室温下固定细胞15min3()min。PBS洗3次。8.4.2 通透封闭用含0.3%TritOn-X100和2%BSA的PBS室温下通透封闭细胞Ih2h。8.4.3 4.3抗体孵育按照抗体说明书进行稀释使用。8.4.4 洗涤用PBS洗3次，每次洗涤5Inin10min。B. 4.5染核弃去PBS,用PBS1:Iooo稀释HOeChSt33342染液处理细胞15min。B.4.6封片每张玻璃片加5U1