1株产γ-氨基丁酸菌株的分离鉴定及发酵特性研究.docx

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1、1株产丫-氨基丁酸菌株的分离鉴定及发酵特性研究陈国伟贾娇杜丹解修超耿敬章邓百万空白N1GA6A1样品发酵液薄层层析显色Kig. 1Colour chart of ihc fcTTnenlalion broth of sampleby thin layer chrornaIOgraphy摘要：对谢村黄酒酒曲中细菌进行分离，利用薄层层析法定性、柱前衍生高效液相色谱法定量筛选出1株产丫-氨基丁酸(Gama-aminobutyric, GABA)能力的菌株N1,通过对该菌株进行形态学观察、生理生化试验、16s rDNA序列分析鉴定，并绘制其生长曲线，研究谷氨酸钠(L-MSG)的添加量、发酵时间、发酵温

2、度等对菌株N1发酵产GABA含量的影响。结果表明：经初筛得到的菌株N1,复筛测得发酵液中GABA含量为448.6 mg LT。结合形态学、生理生化及分子生物学鉴定菌株N1为枯草芽袍杆菌Bacillus subtilis,菌株N1在液体培养04 h处于延滞期，412 h处于指数期，1216 h为稳定期，16 h之后为衰退期；菌株N1最适培养条件为发酵时72 h、发酵温度36。(2、pH值6、接种量2%、装液量100 mL、谷氨酸钠添加量1%,在此条件下菌株N1发酵产GABA含量可达583.5 mg - L-loKey：谢村黄酒酒曲；丫-氨基丁酸；分离鉴定；发酵特性：Q 93-331 文献标志码：

3、A ： 0253-2301 (2021) 12-0012-07DOI： 10. 13651/j. cnki. fjnykj. 2021. 12. 003Isolation, Identification and Fermentation Characteristics of V -aminobutyric acid-producing StrainsCHEN Guo-wei1, JIA Jiaol, DU Dani, 3, XIE Xiu-chaol, 2*, GENGJing-zhangl, DENG Bai-wan1, 2(1. College of Biological Science

4、and Engineering, ShaanxiUniversity of Technology, Hanzhong, Shaanxi 723000, China；2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and MedicinalFungi, Hanzhong, Shaanxi 723000, China；3. Xianyang Academy of Agricultural Sciences, Xianyang, Shaanxi712000, China)Abstract： The bacteria in the yellow ric

5、e wine koji of Xiecun wereisolated, and a strain N1 which was capable of producing Y -aminobutyric acid (GABA) was quantitatively screened by using themethods of thin layer chromatography and precolumn derivatizationhigh performance liquid chromatography. The morphologicalobservation, physiological

6、and biochemical tests, 16S rDNA sequenceanalysis and identification of the strain were carried out, and itsgrowth curve was plotted, in order to study the effects of theaddition amount of sodium glutamate (L-MSG) , fermentation time andtemperature on the content of GABA produced by the strain Nl. Th

7、eresults showed that the content of GABA in the fermentation broth was448. 6 mg e L-l after the initial screening. Combined with theidentification of morphology, physiology, biochemistry andmolecular biology, the strain was identified as Bacillus subtilis.The strain was in the lag phase from 0 to 4

8、h after the liquidculture, the exponential phase from 4 to 12 h, the stable phasefrom 12 to 16 h, and the decline phase after 16 h. The optimumculture conditions for the strain Nl were as fol1ows： fermentationtime 72 h, fermentation temperature 36, pH value 6, inoculationamount 2%, liquid volume 100

9、 mL, and sodium glutamate 1%. Underthese conditions, the content of GABA produced by the strain N1could reach 583.5 mg L-l.Key words： Yellow rice wine koji of Xiecun； Y -aminobutyric acid；Isolation and identification； Fermentation characteristics黄酒(Huangjiu)源于中国，是世界三大酿造酒之一，被誉为“液体面包”3,具有悠久的文化历史，是我国古代

10、礼仪的象征4。谢村黄酒产自陕西省汉中市洋县，起源于上古夏商时期，民间有“南有绍兴加饭，北有谢村黄酒”之说，谢村黄酒是一种具有营养保健功能的发酵型低酒精度酒，2010年已被纳入陕西省第一批非物质文化遗产5。据鉴定，谢村黄酒富含17种人体必需氨基酸，总含量高达115633.66 mg LT,比啤酒高11倍，比红葡萄酒高8倍，比绍兴加饭酒高出1倍多6。”曲为酒之骨” 7-8,酒曲作为酒中产生各种风味物质的动力源泉，其中微生物起到重要作用，微生物之间存在着共生、互生、寄生、拮抗的作用，在麦曲传统制作工艺中，微生物逐渐形成一个复杂并与环境相适应的微生物区系，决定着黄酒的品质9。我国目前对黄酒研究仍然停留

11、在生理效应和活性物质，对于酒曲研究主要集中于微生物产酶，功能活性成分丫-氨基丁酸(GABA)的研究较少，因此本研究对于黄酒中的新型功能因子GABA的研究有潜在应用价值。丫-氨基丁酸(GABA)是非蛋白组织氨基酸，产生机理是由前体物质谷氨酸(L-glu)或谷氨酸钠(L-MSG)经谷氨酸脱覆酶(GAD)催化作用产而来，是动物神经中枢系统的主要抑制性递质10。GABA具有舒降血压、调节抗心律失常11 -12、抗惊厥、镇痛13T5等功能。2009年被国家卫生部配准为新资源食品,成为研究的热门。谢广发等16研究发现我国的古越龙山绍兴黄酒中GABA含量达167360 g LT；龚金炎等17从黄酒浸米液中筛

12、选出产GABA植物乳杆菌，测得其发酵液中GABA浓度为L 02 g*L-lo本研究通过对谢村黄酒酒曲中分离的细菌，采用薄层层析法初筛定性和高效液相复筛定量，并对菌株N1进行鉴定及其发酵特性初步研究，探讨菌株N1在不同条件下的发酵能力，旨在为菌株N1用于生产GABA的研究提供科学参考依据。1材料与方法1. 1材料与仪器1.1.1 试验材料 黄酒酒曲，由陕西秦洋长生酒业有限公司提供。1.1.2 仪器设备 电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，BSA8201）,生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司，SPX25085HH）、显微镜（上海普赫兴电科技有限公司，奥林巴斯CX22）、PCR扩增仪（上海

13、恒久医疗器械有限公司，TA40英国Techne）、电泳仪（上海天能科技有限公司，TAN0AEPS30）、高效液相色谱仪（广东科晓分析仪器公司，Agilent HPLC1220） o 1. 1.3培养基 牛肉膏蛋白月东培养基：牛肉膏5.0 g、蛋白腺10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂15.0 g, pH 自然，蒸储水 1000 mLo发酵培养基：葡萄糖10.0 g、酵母膏10.0 g、蛋白陈5.0 g、硝酸钠3.0 g、七水硫酸镁0.02 g、硫酸镒0.001 g、氯化钠0.001 g、七水硫酸亚铁0.001g、10 g L-MSG、pH 6. 0o其他培养基：甲基红试验培养基、V-P试验

14、培养基等配制方法参照常见细菌系统鉴定手册18 o1.2试验方法1.2. 1黄酒酒曲中细菌的分离 酒曲样本放在灭菌的研钵中粉碎，37, 140min振荡30 min,稀释涂布平板，37。(2恒温培养。观察并挑取单菌落多次划线纯化，纯化后的平板备用，菌液于50%甘油Ep管保藏。1.2.2 产GABA菌株的筛选(1)产GABA菌株的初筛。薄层层析法测定见Reference19。发酵培养：以3%的接种量转接100 mL (250 mL三角瓶)发酵培养基中，37 140r min-1摇瓶振荡发酵72 ho发酵液处理：吸取2 mL发酵液于EP管，1000r min-1 4，C离心5 min,取上清液待测。

15、硅胶板的活化：硅胶板于烘箱1059活化L5 h,待用。展开剂扩散层析缸：将展开剂倒入层析缸底部1cm,盖上玻璃盖，静置1 ho点样、层析、显色：以1 mg - mL-1 GABA标准液和L-MSG标准液为对照，取10 uL发酵上清液，迅速点样后吹干层析，待溶剂扩散至硅胶板上12 cm处取出，立即喷显色剂置于85烘箱显色15 min。(2)产GABA菌株的复筛。PITC柱前衍生化法高效液相测定参照QB/T 4356-2012黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法20 o发酵液处理：同薄层层析法的处理方法相同，得到发酵上清液即为样品原液。样品衍生化、萃取、标准工作液衍生。GABA标品波长扫描：配置不同梯度GABA标品液，衍生化后进行紫外分光光度计全波长扫描，确定最终检测波长。色谱条件：检测波长为扫描波长。标准工作液的配制。测定：进样量10 UL,以峰面积为y轴，浓度为x轴绘制标准曲线。1.2.3 产GABA菌株