H5N1禽流感病毒中和抗体抗原结合表位的分析研究.docx

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1、申请代码：C03011403受理部门：收件日期：受理编号：解除保护国家自然科学基金申请书资助类别：面上项目亚类说明：自由申请项目附注说明：项目名称：H5N1禽流感病毒中和抗体抗原结合表位的分析研究申请者：周伯平电话：0755-25636998依托单位：广东医学院通讯地址：深圳市布心路2019号邮政编码：518020单位电话：0759-2388523电子邮件：zhoubphotmaiI.com申报日期：2007年3月1日国家自然科学基金委员会基本信息申请姓名周伯平性别男I11962年9月民族汉族学位博职称主任医师主要研究领域病毒性肝炎和新发传染病者电话0755-25636998电子邮件Zhoub

2、pQ信传真0755-25634034个人网页息工作单位广东医学院/附属深圳市第三人民医院在研项目批准号名称广东医学院代码52402301联系人吴柱国电子邮件gdmckjc电话0759-2388523网站地址http:/单位名称代码中国科学院上海生命科学研究院上海交通大学医学院健康科学研究所00000000中国科学院上海生命科学研究院20003119项目名称15NI禽流感病毒中和抗体抗原结合表位的分析研究项资助类别面上项目亚类说明自由申请项目目基本附注说明申请代码C03011403:传染病的预防与治疗研究信基地类别息预计研究年限2008年1月2010年12月研究属性基础研究申请经费38.5000

3、万元（限400字）：本项目在我们发现H5N1禽流感患者恢复期血清具有显著的体内抗病毒效果的摘前期工作基础上,采用H5N1假病毒体系,结合EIW转化B细胞单克隆筛选技术分析确定H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位。采用H5N1禽流感病毒感染小鼠模型，对B细胞克隆分泌的中和抗体的体内抗病毒效果进行测定和评价。通过对恢复期血清供者和受者的血清中H5N1禽流感病毒中和抗体谱及其滴度的分析，为人禽流感的免疫血清治疗提供实验室依据，为评价人禽流感疫苗免疫效果提供中和抗体谱的参照。项目的完成所确定的中和抗体抗原结合表位的氨基酸序列，是设计H5N1禽流感亚单位疫苗的重要依据;而分泌中和抗体要的B细胞克隆是

4、制备治疗用单克隆抗体的重要物质基础。关键词（用分号分开，最多5个）黑鬻感病毒，中和抗体，抗原结合表位，细胞克隆，被动免项目组主要成员（注：项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮件项目分工工间1年时月每作I1杨桂林1970-2-17男副主任医师博士广东医学院0755-25509800-2101g1.yang抗体筛选62陆坚1965-5-21男副主任医师博士广东医学院0755-25630437sz1ujian重组蛋白表达63赖伟珍1967-6-16女主管护师其他广东医学院0755-25509800-21011aiwei

5、zhen临床治疗病例随访64李美忠1976-7-7男主管技师学士广东医学院0755-25509800-3122meizhong1免疫学实验35张维1982-9-22女硕士生学士广东医学院0755-25509800-3122xz11426动物实验66曹巍1980-4-8女博士生硕士中国科学院上海生命科学研究院上海交通大学医学院健021-63852704InisscaoweiB细胞克隆筛选67蔡车国1977-1-24男助理研究员硕士中国科学院上海生命科学研究院021-63851363cgcai假病毒的制备68在此录入修改9在此录入修改总人数高级中级初级博士后博1:生硕士生833011说明：高级、中

6、级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。版本1.7544科目申请经费备注(计算依据与说明)一.研究经费34.70001.科研业务费3.5000(1)测试/计算/分析费1.0000HA截断蛋白的设计，抗原表位肽的设计(2)能源/动力费(3)会议费/差旅费1.0000往来香港大学、上海中科院进行实验和交流(4)出版物/文献/信息传播费1.5000SCI论文2篇、中文期刊23篇(5)其它2.实验材料费20.7000(1)原材料/试剂/药品购置费19.2000免疫磁珠、流式抗体、细胞培养试剂，重组蛋白表达，假病毒制备等(2)其它1.5000禽流感患者标本采集

7、和运输3.仪器设备费0.0000(1)购置(2)试制4.实验室改装费5.协作费10.5000中和抗体效价测定及其体内抗病毒效果二.国际合作与交流费0.00001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流三.劳务费2.0000研究生劳务费用四.管理费1.8000合计38.5000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助(含部门匹配)38.5000其他经费来源合计38.5000(金额单位：万元)经费申请表查看报告正文撰写提纲I报告正文一、项目的立题依据和研究内容1.项目的立题依据1）研究目的和意义人感染H5N1型高致病性禽流感病情重、病死率高（超过50%），目前还没有特异有

8、效的治疗药物和方法。2003年底以来，亚洲地区持续暴发H5N1型高致病性禽流感。同时，禽流感跨重属之间传播的现实提示，禽流感病毒在人与人之间的传播并造成爆发流行只是时间问题。抗流感病毒药物奥司他韦一般在发病后48小时内使用有一定作用，而临床上绝大多数患者确诊时已经错过了最佳时机。与此同时，奥司他韦抗药性的H5N1耐药株的出现，提示无论是预防还是治疗，奥司他韦均不可能是一个满意的答案。另一个应对的选择就是预防性疫苗的应用，但由于病毒的高致病性，目前离研制出大量有效稳定的疫苗还有相当远的距离。在这一方面，亚单位流感疫苗在安全性和大量制备工艺上有明显的优势，但有赖于H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结

9、合表位的确定。被动免疫是有效预防和治疗流感的另一可能策略。采用免疫血清被动免疫治疗在许多病毒性疾病取得了很理想的结果。其中，最能引起人们注意的是2003年的恢复期血浆有效治疗SARS病毒感染的报道。因此，有理由相信免疫血清治疗对同为病毒性疾病的人禽流感应该是一个有效的方法。目前，有关免疫血清的中和抗体的抗原特异性（抗原结合表位）、中和抗体的体内抗病毒作用及其机制、免疫血清/抗体治疗的疗效预测指标和临床使用的指南性方案等等许多问题还不清楚。从而限制了免疫血清治疗人禽流感的临床应用。只有对这些问题的深入研究，才能为人禽流感的被动免疫治疗提供切实可行的方案。而解决这些问题的关键切入点就是对中和抗体的

10、抗原结合表位的分析。因此，本项目在我们发现H5N1禽流感患者恢复期血清具有显著的体内抗病毒效果的前期工作基础上，采用H5N1假病毒体系,结合EBV转化B细胞单克隆筛选技术分析确定人H5N1禽流感病毒中和抗体的抗原结合表位。采用H5N1禽流感病毒感染小鼠模型，对B细胞克隆分泌的中和抗体的体内抗病毒效果进行测定和评价。通过对恢复期血清供者和受者的血清中H5N1禽流感病毒中和抗体谱及其滴度的分析，为人禽流感免疫血清治疗提供实验室依据，为评价人禽流感疫苗免疫效果提供中和抗体谱的参照。项目的完成所确定的中和抗体抗原结合表位的氨基酸序列，是设计H5N1禽流感亚单位疫苗的重要依据；而分泌中和抗体的B细胞克隆

11、是制备治疗用单克隆抗体的重要物质基础。2）国内外研究现状及分析a.免疫血清/特异性抗体治疗人H5N1禽流感病毒感染的效果据我们调查，除我们之外，目前还没有采用免疫血清治疗人禽流感的报道。主要的担忧是流感病毒抗原变异导致中和抗体无法有效的中和病毒。对甲型流感病毒H3N2的血凝素（HA）抗原区分析后，确定了两个突出表面的位于靠近受体结合区的肽环，分别是140-146位氨基酸残基组成的的140s环和155-164位氨基酸残基组成150s环，是中和抗体的结合识别部位。研究显示，这些肽环易于发生抗原漂移和突变进而导致这些区域的糖基化，使得中和抗体无法与相应的区域结合。相似的肽环也在H5N1病毒中发现，对

12、不同H5N1病毒株HA同一区域的氨基酸序列分析发现，2004年从越南分离的H5N1病毒株存在可能糖基化的氨基酸位点口网。上述抗体因可阻断病毒吸附到宿主细胞而可能具有较强的中和病毒作用，但从理论上讲，中和抗体不仅仅包含针对上述两个肽环特异性的抗体。针对病毒的其他相对保守抗原如HA其他区段的抗体包括受体结合区的190Q螺旋（190-he1ix）,或作用于病毒复制的吸附后阶段的病毒特异性抗体如NA的抗体，同样可以中和病毒作用网。因此，理论上采用H5N1禽流感患者恢复期血浆或接受H5N1病毒疫苗免疫的免疫血清治疗同为H5N1病毒的感染，存在因基因变异而导致抗一HA中和抗体无法结合相应抗原的可能很小。1

13、U等报道采用灭活的非致病性H5N2病毒（ADuckPottSdam/1042-6/86）为疫苗免疫小鼠产生的抗体可以交叉保护宿主对高致病性H5N1的病毒感染。2006年，我们对收治的深圳市首例重症禽流感患者进行了H5N1禽流感患者恢复期血浆治疗，发现在给予恢复期血浆治疗后，患者体内病毒量迅速下降U（U1在输注血浆后32小时内，病毒载量从3.94k）gcopiesm1降至低于检测下限水平，下降近10,Ooo倍。连续监测病毒载量显示患者体内病毒量已得到有效的控制和清除。伴随病毒载量的下降，患者的临床表现、肺功能和胸部放射学检查均有明显的改善。据我们了解，这是全世界第一个，也是迄今为止唯一一个采用恢复期血浆治疗人H5N1禽流感的报道【。尽管由于缺乏病例对照，1例患者免疫血浆治疗的成功不好断言免疫血浆（血清）的治疗效果，但我们的观点得到其他实验室结果的支持H。HanSon等和1U等分别采用人源化的抗甲型流感H5血凝素抗原的单克隆抗体和H5N1免疫的马免疫球蛋白的F（ab,）2治疗致死剂量H5N1感染的小鼠，发现被动免疫能够有效的保护感染小鼠，显著降低感