NSFCproposal－龚朝辉.docx

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1、收件日期：受理编号：申请代码:受理部门:检查保护国家自然科学基金申请书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：1）如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:“中“方法:Word菜单工具-宏，安全性,安全级,设置为“中“（如果您是Wor（197用户，继续执行以下步骤）2）关闭本文档，重新打开本文档3）点击，启用宏”按钮，即可开始填写本文档或打印了申报日期：2006年3月20日国家自然科学基金委员会基本信息申请者信息姓名龚朝辉性别甲出生为年月1978年11月民族汉族学位硕士职称助理研究员主要研究领域生物化学与分子生物学，基因工程电话0571-868431

2、90电子邮件ZhgongQ传真0571-86843198个人网页工作单位浙江理工大学/生命科学学院生物化学研究所在研项目批准号依托单位ew名称浙江理工大学代码31001204联系人张琪电子邮件Zhangqi电话0571-86843052网站地址合作单位信息单位名称代码在此录入修改在此录入修改项目基本信息项目名称家蚕中HiicroRNA的基因鉴定与功能研究资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明申请代码CoIO40102:核酸Co1O401:生物分子的结构与功能、合成机理及调节过程基地类别预计研究年限2007年1月2008年12月研究属性基础研究摘要（限400字）：MiCrORNA（微RNA

3、,miRN）是一类长约22个核甘酸的小分子非编码RNAo尽管在相关的模式生物基因组中miRNA基因被大量的发现，但在家蚕发育环节中miRNA功能研究至今没有报道。家蚕既是一种能吐丝的经济动物，同时又能作为生物反应器生产药用重组蛋白。本研究以家蚕为模式生物，开展对家蚕发育过程中不同时期的miRNA研究，确定其miRNA基因序列，并选择性地研究若干重要miRNA基因的结构模式和功能，以此来分析家蚕在不同成长时期蛋白质的表达调控模式。我们通过确定miRNA分子在家蚕生长和发育分化中的作用，来进一步阐明影响家蚕经济性状的分子机理并在分子水平上揭示家蚕发育和生理过程，填补国内外在家蚕miRNA领域研究的

4、空白。关键词（用分号分开，最多5个）家蚕；微RNA；RNA干涉；转录调控；表达项目组主要成员（注：项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮件项目分工工间1年时月每作I1蒋彩英1977-12-18女助理研究员博士浙江理工大学057186843194jcyacai杂交分析32刘玉明1977-2-22男助理研究员硕士浙江理工大学0571868431941iu16序列比对分析33聂作明1975-12-18男讲师硕士浙江理工大学057186843194WUXinZmmiRNA基因鉴定44龙晓辉1974-1-1女博士生硕士浙江理

5、工大学057186843190xh1ong0717miRNA功能分析35蓝航莲1978-1-1女博士生硕士浙江理工大学0571868431901anh1miRNA靶标鉴定36在此录入修改7在此录入修改8在此录入修改9在此录入修改总人数高级中级初级博士后博1:生硕士生0说明：高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。版本1.000.000科目申请经费备注(计算依据与说明)一.研究经费25.75001.科研业务费15.7500(1)测试/计算/分析费8.5000CDNA文库构建、CDNA测序、NorthernBIOt分析(2)能源/动力费1.250

6、0按照5%计算(3)会议费/差旅费3.0000国内外学术交流(4)出版物/文献/信息传播费3.0000版面费，专利申请费(5)其它2.实验材料费10.0000(1)原材料/试剂/药品购置费8.0000各种分子生物学实际，细胞培养，体外转录，免疫检测试剂等(2)其它2.0000常规实验耗材等3.仪器设备费0.0000实验设备齐全，无需购置(1)购置(2)试制4.实验室改装费实验室条件完好，无需改装5.协作费二.国际合作与交流费4.00001.项目组成员出国合作交流2.0000拟派1名项目组骨干成员去国外短期学习2.境外专家来华合作交流2.0000聘请国外专家来访讲学三.劳务费4.0000按不超过

7、15%四.管理费1.5000按不超过5%计算合计35.2500与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助(含部门匹配)其他经费来源合计0.0000(金额单位：万元)经费申请表查看报告正文撰写提纲I报告正文(一)立项依据与研究内容(4000-8000字)：1.项目的立项依据MiCrORNA(微RNA,miRNA)是一类长约22个核甘酸的小分子非编码RNAomiRNA可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合，抑制该蛋白的合成或诱导该mRNA的降解，从而参与基因的表达调控“3】。miRNA在各种生物中普遍存在,现已从动物的线虫、果绳、家鼠、人体及植物的拟南芥中都分离到了miRNA口-。

8、查询专业的miRNA数据库一一miRBase(http:/microma.sanger.ac.uk/)得知,目前已经发现有3000多条miRNA序歹Ib但其中只有一半的的miRNA功能通过实验确定U。序列同源性比对发现在其他物种中也存在大量miRNA,其数量远未达到饱和。此外，除了少数几个如-4、37等的功能研究得比较清楚外，大多数的miRNA的生理功能尚不清楚。因此，开展对几种常见的模式生物的miRNA研究是至关重要的。微RNA分子的序列短小，在基因组中存在较多的互补序列，在不同生物体内与靶标结合的方式也不尽相同，而且通常还与多种蛋白相互作用，这使得建立一个有效而且普遍适用的研究方法异常困难

9、。虽然如此，科学家仍在不断努力，并在miRNA基因鉴定、生理功能和靶标研究中取得了明显的突破。在各种小分子RNA中，miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,长度在18-26nt,是由一段具有发夹结构的长度为70-10Ont的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。微RNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区。其转录独立于其他基因，并不翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起到多种调控作用。它通过与目标mRNA基因的3端非编码区域(3UTR)互补匹配导致该mRNA基因的翻译受到抑制。由于miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性，并

10、且在茎部的保守性更强；但在环部可以容许更多的突变点存在。基于这些特点，使得运用多种实验方法以及生物信息学方法来预测和确定miRNA成为可能e2，众所周知，家蚕既是非常重要的经济昆虫，又是极其重要的模式生物。作为模式动物与哺乳动物基因组相比，家蚕基因组相对简单，且个体较大。其单倍体完全基因组长度为450M左右，共有28对染色体。这给细胞生命活动的机理及发育生物学研究提供了一个非常合适的材料。止匕外，家蚕在基础生命体系、物质代谢、能量代谢和遗传方式上与人类有很大的相似性。家蚕遗传资源存在大量疾病模型，如癌症模型、糖尿病模型、发育畸形模型等。通过研究这些遗传模型，将在克隆人类疾病控制新基因、研究疾病

11、机理和开发新药物上发挥重大作用，对解决人类疾病、寿命等重大问题具有重要参考价值。另外，家蚕是理想的生物反应器，家蚕体内的丝腺是一个高效率的蛋白质工厂，通过基因组研究，彻底阐明茧丝生产的调控机理，可使家蚕生产对人类有益的高纯度药用蛋白质。在各种小分子RNA中，microRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,长度在18-26nt,是由一段具有发夹结构的长度为70-100nt的单链RNA前体（pre-miRNA）剪切后生成。MiCroRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区。其转录独立于其他基因，并不翻译成蛋白质，而是在体内代谢过程中起到多

12、种调控作用。它通过与目标mRNA基因的3端非编码区域（3UTR）互补匹配导致该mRNA基因的翻译受到抑制。由于microRNA在各个物种间具有高度的进化保守性，并且在茎部的保守性更强；但在环部可以容许更多的突变点存在。这些特点，使得利用生物信息学的方法来预测microRNA成为可能1T8。最早发现的micro是在线虫的1et-7和1in-40运用多种实验方法以及生物信息学方法，至今已找到了3518种microRNA基因序列19-21,并被收入专门的数据库miRBase数据库。根据IniCrORNA的大小、丰度以及其生物来源，国际上提出了一套通用的microRNA命名和注释的标准：（1）通过No

13、rthernd杂交可以从以大小分级的RNA样品中检测到18-26nt的转录物；（2）可以从以大小分级的CDNA文库中分离得到，且来源是所建库的生物基因组；（3）有能形成发夹结构的前体，且该发夹结构中的一条臂上包含有microRNA序列，发夹必须是具有最低能量的预测结构；此外发夹结构的其中一条臂上必须含有22ntmicroRNA核甘酸中的至少16nt预测的结构中不应该有大的内部环或泡，特别是不能有大的不对称的泡；（4）进化上高度保守的microRNA和它的发夹结构前体,保守的发夹要符合标准（3）中的最小配对碱基的要求，但不必是能量最低；（5）随着Dicer酶的功能活性降低，可以检测到生物体中前体的积聚。在与家蚕近缘昆虫（例如果蝇、蜜蜂、蚊子等）microRNA研究中，已发现了上百种miCroRNAo其中在Anophe1esgambiae中发现了38种，Apisme11ifera中找到了25种，Drosophi1ame1anogaster中发现了78,Drosophi1apseudoobscura中有73种21。在这些microRNA序列中，仅有78个是非100似的。这些microRNA序列、结构、丰度和表达方式的多样性使其可能作为mRNA表达的调节子，对基因表达、细胞周期调控乃至个体发育过程都起了重要的调控作用。尽管在相关的模式生物基因组中microRNA基因被大量的发现，但在家蚕