TGXAS-桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程编制说明.docx

《TGXAS-桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程编制说明.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TGXAS-桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程编制说明.docx（9页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程编制说明-征求意见稿一、项目来源根据广西标准化协会关于下达2023年第八十批团体标准制定项目计划的通知（桂标协（2023）196号）文件精神，由广西壮族自治区蚕业技术推广站提出，广西壮族自治区蚕业技术推广站起草的团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程（项目编号：2023-8005）o二、项目背景和目的意义我国是世界蚕业起源中心，也是世界上桑树种质资源最为丰富的国家。广西又是全国蚕桑第一大省。广西于2005年起蚕茧产量成为全国第一大省，2006年起桑园面积成为全国第一大省（区）。20162023年，全区桑园面积基本稳定在300万亩，占全国桑园面积

2、的25%左右。蚕茧产量40万吨，年蚕茧产值平均值为157.5亿元，连续16年位居全国第一。蚕桑产业已成为农民增收、农业增效和促进社会主义新农村建设、构建富裕文明和谐新广西的一大亮点，极大促进了广西乡村振兴和精准扶贫。而桑树青枯病却严重阻碍着广西桑树产业的发展。桑树青枯病、赤锈病以及菌核病等严重危害着蚕桑产业的发展。选育抗病品种是防止桑树染病的有效措施，而抗病育种成败的关键则是抗性基因的挖掘及其功能研究。与此同时，桑树产业的发展必须解决好保护现有耕地以及与粮食种植争地的问题。广西是中国喀斯特地貌的典型地区，喀斯特地貌面积约占广西总面积的37%,由于桑树良好的生态适应特性，使得在喀斯特地貌地区等干

3、旱、盐碱地和石漠化地区栽培桑树成为可能及，如此不但能有效地保护现有耕地，而且也能获得良好的生态经济效益。因此对桑树耐旱、耐盐碱关键基因的挖掘及，将有助于进一步拓宽桑树的种植面积，进一步促进广西桑树产业的提质增效。综上，需要一种快速检测桑树抗性基因功能的方法。实时荧光定量技术是实时荧光定量PCR（rea1timef1uorescencequantitativePCR,qPCR）是1996年由美国App1iedBiosystems公司推出的一种新的定量技术，将荧光标记物加入体系，PCR扩增的同时，荧光标记物也同比例扩增，通过仪器读取整个时期荧光信号强度即可了解产物的实时扩增情况，并对待测样品的初始

4、模板进行定量或定性分析。韦燕梅等利用荧光定量PCR分析了%初外基因在高温、低温、高盐和干旱等非生物胁迫下的转录水平，结果表明论初的宓基因均有响应，其中对低温胁迫诱导最为显著，表达量为对照的40倍左右。研究结果为进一步研究桑树扬初以基因的生物学功能及桑树的抗逆机理提供了帮助。本标准规定桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程的术语和定义及RT-PCR检测方法,对抗病及抗旱等抗逆性强的桑树品种分子选育提供一定指导意义。受气候、技术、市场、环境等因素的影响，我国蚕桑生产依然面临着家蚕微粒子病、桑树病虫害、自然灾害等因素所造成的生产风险。通过传统育种方法和现代分子育种技术相结合，开展优质、高抗等桑树品种选

5、育。利用荧光定量PCR技术可以快速分析不同逆境胁迫下基因的表达差异，能够快速了解基因的初步功能，对桑树的分子育种提供了基因源及研究方向。但是有关桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程目前尚没有国家标准和地方标准，为了规范桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程，确保快速、高效的桑树基因功能检测技术，促进桑树抗逆品种选育，我站申请制定桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程项目任务下达后，广西壮族自治区蚕业技术推广站成立了标准编制工作组，制定了标准编写方案，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准编制工作，具体标准编制工

6、作由广西壮族自治区蚕业技术推广站相关人员配合。（二）收集整理文献资料编制工作小组成员根据任务分工进行了资料收集和调查研究分析，一是收集国内国外相关的法律法规和技术标准，了解逆境胁迫下桑树功能基因荧光定量RT-PCR检测技术等方面的相关资料；二是组织技术人员到相关企业、科研院所进行实地考察，了解并掌握当前RT-PCR检测技术的情况，提高标准的适应性和普遍性，为我区菜用桑种植普遍适用的技术依据。标准编制工作组收集了国内有关桑树功能基因荧光定量RT-PCR检测的相关技术文献资料。主要有：DB14/T1414桑树播种育苗技术规程DB21/T2395-2015稻蕴病菌无毒基因检测PCR法DB21/T23

7、96-2015水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法DB37/T1019-2008大豆及其制品中抗草甘瞬转基因成分的实时荧光定量PCR检测方法DB45/T86-2003桑树栽培管理技术规程DB53/T944-2019甘派抗褐锈病基因Bru1的PCR检测技术DB65/T4215桑树育苗技术规程S/T2271-2009青椒中专基因成分定性PCR检测方法（三）研讨确定标准主体内容2023年11月，广西标准化协会下达关于下达2023年第八十批团体标准制定项目计划的通知（桂标协（2023）196号）文件，根据文件精神，桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程立项（项目编号：2023-8005）o2023年1-3月

8、，成立标准起草编写小组，明确任务分工；编制标准制定技术设计和实施方案；标准相关资料收集、调查和研究工作，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关桑树荧光定量RT-PCR检测操作的内容指标，并结合桑树荧光定量RT-PCR检测技术实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成了团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程（草案）。2023年4-5月，向区内涉及领域的部门及相关专家征求团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程（草案）意见。2023年6月，标准组深入广西各地实地调研，并实地征求团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程（草案）意见。2023年7-8月，标准编制工作组在广西壮族自

9、治区蚕业技术推广站会议室组织涉及的部门专家对团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程（草案）进行征求意见会。最终讨论形成团体标准桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程（征求意见稿）和编制说明。报送广西标准化协会进行网上征求意见。四、标准制定原则（一）实用性原则本文件中有关桑树RT-PCR检测技术内容及要求的规定，是在充分收集相关资料和文献，分析桑树RT-PCR检测技术当前现状，调研区内RT-PCR检测技术的基础上，进行制定。坚持从我区丰富的农业资源条件和市场需求出发，综合考虑我区桑树的生长发育特点，分析技术风险性，使之具有较强的实用性和指导性。本标准对材料处理、RNA提取、cDNA的合成、内

10、参基因的引物设计、桑树荧光定量RT-PCR反应程序、基因相对表达量计算方法等操作进行了更科学的规范，主要环节、关键技术已反复验证,使之简单易行，便于操作。符合当前区内桑树RT-PCR检测技术发展水平，具有较强的实用性和可操作性。（二）协调性原则本文件在标准编写过程中注意了与桑树RT-PCR检测技术相关法律法规、标准的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。（三）规范性原则本文件严格按照GB/T1.1-2023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的要求和规定编写本文件的内容，保证标准的编写质量。（四）前瞻性原则本文件在兼顾当前区内桑树RT-PCR检测技术的现实情况的同时，还

11、考虑到了桑树RT-PCR检测技术的需要，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款，作为对菜用桑行业发展的引导。五、标准主要章节内容及确定依据团体标准桑树荧光定量RJPCR检测操作规程主要章节内容包括：材料处理、RNA提取、cDNA的合成、内参基因的引物设计、桑树荧光定量RT-PCR反应程序、基因相对表达量计算方法等操作进行了更科学的规范。项目以广西蚕桑产业可持续发展中的重大科学问题和关键技术问题为导向，针对桑树生产的分子育种，针对性设计及检测方法。研究主要集中在桑树抗逆基因的表达谱分析及筛选等方面。本研究室采用实时定量PCR（RT-qPCR）研究了干旱、UV,病原体、激素等处理下桑树例杨7

12、S幻S、CCD、必物等基因的表达模式。与标准生长环境相比，这些基因的InRNA水平在逆境胁迫处理中表现出显著变化，这些发现为桑树在胁迫反应中的信号转导的分子基础提供了有用的参考信息。以这些研究结果为基础成功发表了5篇SC1论文。（一）苗木准备利用水培法培养桑树种子直至种子生根发芽后将其种植在含有营养土的花盆中，放置于PQX植物培养箱中，温度为26C,光周期为12h,直到地上部分长至25cm30cm,然后，挑选长势一致的用于后续逆境胁迫处理。只有挑选长势一致的苗木作为实验材料，后续实验实验结果才可信。（二）材料逆境胁迫处理以干旱处理为例，用8%PEG6000模拟干旱处理桑树幼苗，分别于处理后0、

13、8、24、32和48h后收获并在-80储存干旱处理过的叶片（每6盆植物作为一个样品处理组）。用未经处理的幼苗作为对照。PEG6000诱导水份逆境所产生的效果与将土壤逐步干旱是一致的，而且PEG6000不会穿过细胞壁，化学性质稳定，对植物毒性小，比较适合干旱模拟。表1不同方法模拟干旱处理8h后9以S/基因的表达量分析名称PEG质量分数/*相对表达量（处理1）相对表达量（处理2）相对表达量（处理3）三次处理平均值误差PEG400041.320.931.651.300.36PEG400081.802.302.702.260.45PEG600041.101.501.801.470.35PEG60008

14、1.902.112.122.OOO.12从表1中可以看到，上述四种胁迫方法对桑SqS/基因的表达量分析均产生了影响，从三次重复结果来看8%PEG6000模拟干旱的方法实验结果误差最小，结果稳定，可重复性好。故选择8%PEG6000模拟干旱胁迫。（三）RNA提取及CDNA的合成RNA提取的步骤如下：a）取100mg桑树材料于研钵中加入液氮迅速研磨直至研磨成细粉；b）将研钵中的细粉迅速转移到1.5m1的离心管中，加入1m1RNAisoP1us试剂或其他适用于提取桑叶总RNA的试剂，剧烈震荡混匀，室温静置3min；c）12000rpm,4,离心5min；d）吸取上清液于新的1.5m1离心管中，加入上

15、清液1/5体积氯仿，充分涡旋后室温静置5min；e）4,12000rpm,离心5min；f）吸取上清液于新的1.5nd离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；g）4,12000rpm离心10min,此时，离心管底部可见RNA沉淀；h）弃上清液，加入Im1用DEPC（diethy1pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯）水配制的75%乙醇，轻柔上下颠倒几次，4,12000rpm离心2min；D重复步骤（8）,离心完毕后，弃上清液，敞开盖子室温干燥；j）加入适量DEPC水溶解RNA；k）用Nanodrop2000分光光度计检测RNA浓度和质量，纯RNAOD260nm0D280nm的比值为2.0,0D260nm0D280nm的比值范围在18-2.1之间可进行下一步实验。cDNA的合成cDNA第一链的合成使用TCDNA第一链的合成使用Takara反转录试剂盒（PrimerScriptRTreagentKit）或其他公司的反转录试剂盒，步骤如下：a）消化DNA在RnasefreePCR管中加入如下试剂：5XgDNAEraserBuffer2u1、gDNAEraser11,Tota1RNA1g,所有组分加入完毕后，用移液枪轻轻吹打混匀，瞬时离心后42处理2min,立即放到冰上；