TGXAS-桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程.docx

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1、ICS65.020CCSB67T/GXAS团体标准T/GXASXXXX-XXXX桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程CodeofpracticeofmuIberryrea1-timequantitativeRT-PCR（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布本文件参照GB/T1.1-2023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区蚕业技术推广站提出、归口并宣贯。本文件起草单位：

2、广西壮族自治区蚕业技术推广站、百色市蚕业站、广西南宁天龙生物科技有限公司。本文件主要起草人：刘丹、黄胜、邱长玉、林强、韦伟、张朝华、陆晓媚、曾燕蓉、朱光书、黄琼玲、崔秋英、冉艳萍。桑树荧光定量RT-PCR检测操作规程1范围本文件界定了荧光定量RT-PCR检测操作相关的术语和定义，给出了材料处理、RNA提取、cDNA的合成、内参基因的引物设计、桑树荧光定量RT-PCR反应程序、基因相对表达量计算方法等操作指示。本文件适用于逆境胁迫下桑树功能基因荧光定量RT-PCR检测操作等技术。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。1.1荧光定量RT-PCRRea1-

3、timequantitativeRT-PCR将荧光标记物加入PCR体系，PCR产物扩增的同时，荧光标记物也同比例扩增，通过仪器读取整个时期荧光信号强度即可了解产物的实时扩增情况，并对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。1.2荧光阈值thresho1d在荧光信号检测中，为了区分背景噪声和真实信号而设置的一个阈值。1.3Ct值Theva1ueofcyc1ethresho1d每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。1.4内参基因Referencegene在细胞中的表达量或者在基因组中的拷贝数相对恒定。1.5相对定量分析Re1ativequantitativeana1ysis测定目的基

4、因在两个或多个样本中的含量的相对比例，不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。4材料处理4 .1苗木准备利用水培法培养桑树种子直至种子生根发芽后将其种植在含有营养土的花盆中，放置于PQX植物培养箱中，温度为26C,光周期为12h,直到地上部分长至25cm30cm,然后，挑选长势一致的用于后续逆境胁迫处理。4.2逆境胁迫处理以干旱处理为例，用8%PEG6000模拟干旱处理桑树幼苗，分别于处理后Oh、8h、24h.32h和48h后收获并在-80C储存干旱处理过的叶片（每6盆植物作为一个样品处理组）。用未经处理的幼苗作为对照。5 RNA提取RNA提取的步骤如下：a）取IOOmg桑树材料于研钵中加入液氮迅

5、速研磨直至研磨成细粉；b）将研钵中的细粉迅速转移到15m1的离心管中，加入1m1RNAisoP1us试剂或其他适用于提取桑叶总RNA的试剂，剧烈震荡混匀，室温静置3min；c）12000rpm,4,离心5min；c1）吸取上清液于新的15m1离心管中，加入上清液1/5体积氯仿，充分涡旋后室温静置5min；e）4,1200OrPnI,离心5min；f）吸取上清液于新的15m1离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置IOmin；g）4,12OOOrpm离心IOmin,此时，离心管底部可见RNA沉淀；h）弃上清液，加入Im1用DEPC（diethy1pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯

6、）水配制的75%乙醇,轻柔上下颠倒几次，4,12000rpm离心2min；i）重复步骤（h）,离心完毕后，弃上清液，敞开盖子室温干燥；j）加入适量DEPC水溶解RNA；k）用Nanodrop2000分光光度计检测RNA浓度和质量，纯RNA0D260nm0D280nm的比值为2.0,0D260nm0D280nm的比值范围在1.8-2.1之间可进行下一步实验。6cDNA的合成cDNA第一链的合成使用TCDNA第-链的合成使用Takara反转录试剂盒（PrimerSCriPtRTreagentKit）或其他公司的反转录试剂盒，步骤如下：a）消化DNA：在RnasefreePCR管中加入如下试剂：5g

7、DNAEraserBuffer21gDNAEraser11Tota1RNA1g,所有组分加入完毕后，用移液枪轻轻吹打混匀，瞬时离心后42C处理2min,立即放到冰上；b）反转录RNA：在第一步的样品中依次加入如下试剂：Reactionso1utionfromStep1101RnasefreeddH204p1、5PrimerScriptBuffer24p1、RTPrimerMix1p1、PrimerScriptRTEnzymeMixI11,用移液枪轻轻吹打混匀，瞬时离心，按如下程序进行反应：3715min；855s；4RoxReferenceDye2.0g1、模板2.0g【,、ddH205.01Tota120108.2 反应程序：95预变性51115，95变性10s,60退火15s,72C延伸10s,3545个循环。每个样品设3个生物学重复，每个生物学重复设3个技术重复。9基因相对表达量计算方法使用2方法计算相对表达。ACt=（Ct口的酬-CtA3）；Ct=（Ct处理-ACt未处理）。“2一AAC对照=1o如果“2”目的基因1”,则基因在逆境胁迫下的表达量上调，反之基因的表达量下调。