2022年省科技脑血管标书.docx

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1、摘要缺血性脑卒中是威逼人类安康的主要疾病，是人口死亡的主要缘由之一，目前已经公认该疾病同时受遗传和获得因素的影响，而对获得因素的把握可以延缓或逆转疾病的发生和发展。缺血性脑卒中的发生涉及动脉粥样硬化和血栓形成，而与此相关的三个基因位点亚甲基四氢叶酸复原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和血栓调整蛋白（TM）的表达水平与这两个过程亲热相关，这些基因的突变已被证明与缺血性脑卒中相关。DNA甲基化修饰是一种使DNA发生化学修饰、无基因序列转变、但可遗传、可逆的表观遗传修饰方式，是表观遗传学的重要争辩内容之一，表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果。过去争辩觉察基因启动

2、子区甲基化修饰的转变会影响到基因的表达水平，从而导致疾病发生，然而缺血性脑卒中相关基因启动子区甲基化修饰状况转变是否与缺血性脑卒中形成的相关，目前未见报道。故本争辩拟承受病例比照争辩的方法，利用基因测序技术、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA方法）和SIRPH分析技术对这三个基因启动子区的甲基化修饰状况与缺血性脑卒中的关系进展争辩。争辩成果将有助于缺血性脑卒中的早期干预，及查找新的治疗靶点，为深入争辩缺血性脑卒中的发病机制、临床诊断供给新的视角。四、主要争辩开发内容和要到达的主要技术、经济指标以及将供给的争辩开发成果及形式1、主要争辩开发内容：1 .缺血性脑卒中患者特定基因甲基化修饰状况

3、的检测：以病例比照争辩的方法，使用基因测序方法、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA方法）和SIRPH分析技术，并与同步检测的高血压组和正常比照组比较，测定启动子区的甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。2 .分析三种基因的表达水平，分析动脉粥样硬化相关基因亚甲基四氢叶酸复原酶（MTHFR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和凝血相关基因血栓调整蛋白（TM）启动子区的甲基化修饰程度与缺血性脑卒中的相关性。3 .综合启动子区甲基化水平与基因表达水平及患者的临床表现，开发出一套较为完善的分子诊断方法。2、要到达的主要技术、经济指标：1 .完成动脉粥样硬化相关基因亚甲基四氢叶酸复原酶（MTH

4、FR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）和凝血相关基因血栓调整蛋白（TM）启动子区的甲基化修饰程度与缺血性脑卒中的关系争辩，通过该争辩获得缺血性脑卒中分子诊断的新位点和治疗的新靶点，以便使更多患者获得早期诊断和有效救治，而且能填补我国这方面的争辩空白。2 .使用基因测序方法、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA方法）和SIRPH分析技术测定该争辩基因启动子区甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。3 .对缺血性脑卒中的早期诊断和治疗将有助于削减我国缺血性脑卒中的致死率和致残率，削减国家和个人的医疗费用。3、将供给的争辩开发成果及形式：1,预期可获得我国缺血性脑卒中相关基因甲基化修饰状况，

5、以及缺血性脑卒中与MTHFR、LDLR和TM基因DNA甲基化修饰的关系，并为缺血性脑卒中的基因诊断和治疗供给新方向。2 .使用基因测序方法、甲基化敏感单链构象分析法（MS-SSCA方法）和SIRPH 分析技术测定启动子区的甲基化修饰水平，比较三种方法的可行性和有效性。3 .成果以论文形式在国家核心刊物上发表25篇。一、立项依据(一)目的和意义本争辩从表观遗传学角度，拟承受病例比照争辩的方法，利用基因测序技术、甲基化敏感单链构象分析法(MS-SSCA方法)和SIRPH分析技术，对缺血性脑卒中与动脉粥样硬化和血栓形成这两个病理过程中所涉及的三个相关基因：亚甲基四氢叶酸复原酶(MTHFR)、低密度脂

6、蛋白受体(LDLR)和血栓调整蛋白(TM)进展争辩，观看其编码基因启动子区DNA甲基化的修饰状况，并探讨其与缺血性脑卒中的相关性，成果将有助于缺血性脑卒中的早期干预，及查找新的治疗靶点，本工程将为深入争辩缺血性脑卒中的发病机制、临床诊断打下根底。(二)国内外概况目前脑血管病已成为我国城市和农村人口的第一位致残和死亡缘由，且发病有逐年增加的趋势，我国每年有150万200万新发脑卒中病例，其中缺血性脑卒中占全部脑卒中的60%80%,随着人口老年化和经济水平的快速进展及生活方式的变化，缺血性脑卒中发病率明显上升，提示以动脉粥样硬化为根底的缺血性脑血管病(包括短暂性脑缺血发作，TIA)发病率正在增长。

7、全国脑卒中患者直接医疗费用支出年年递增，与医疗支出日益增长相对应的是脑卒中发病率不但未降，反而以每年10%的速度递增1。因此，早期诊断和治疗将有助于削减我国缺血性脑卒中的致死率和致残率，削减国家和个人的医疗费用。缺血性脑血管病是以动脉粥样硬化为根底的，目前，争辩觉察导致动脉粥样硬化的缘由很多，其中高半胱氨酸(Hey)血症是导致动脉粥样硬化(AS)的危急诱发因素，并增加了脑卒中发生的风险1、2o其致As的机制包括损伤血管内皮细胞、促进平滑肌细胞增殖、导致氧化应激、激活炎症过程等2。同时血中高半胱氨酸水平还会引起血液的高凝状态和增加血小板的聚拢性3,参与血栓的发生4。 Hey是在肝脏、肌肉及其它一

8、些组织中由蛋氨酸(methionine,Met)脱甲基生成的一种含疏基的氨基酸。在体内，Hey通过蛋氨酸合酶催化的甲基化反响可以转化成Met,这种酶促反响需甲基四氢叶酸为甲基的供体，后者由亚甲基四氢叶酸复原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)催化产生，MTHFR是蛋氨酸代谢中的一个关键酶，该酶活性受其辅酶叶酸、维生素B12的影响。当MTHFR活性减低或表达下降时，消灭高半胱氨酸血症5。MTHFR基因错义突变也可引起MTHFR缺陷，如热不稳定性及活性降低，其中677位C/T碱基突变最常见。人MTHFR基因定位于染色体1P36. 3上，MTHF

9、R677C-T突变导致原第222位密码子所编码的丙氨酸由缀氨酸替代，该突变位于亚甲基四氢叶酸复原酶N末端的催化区域,突变造成MTHFR热不稳定，使MTHFR活性下降，从而导致同型半胱氨酸(Hey)增高6、7o国内外争辩觉察：MTHFR基因变异会是导致高同型半胱氨酸血症，引发动脉粥样硬化性疾病，使缺血性脑血管病的患病机率上升8-11。MTHFR的表达水平下降必将也导致血浆中同型半胱氨酸水平的上升，从而引发缺血性脑血管病。MTHFR表达的下调会受到多方面的调控，包括遗传和后天获得性因素，其中基因启动子区的CpG岛的甲基化可能是下调或关闭基因转录的最重要的调控方式之一。已经明确LDL特别在AS发生中

10、占有举足轻重的地位，而且胆固醇水平与缺血性脑卒中的关系很大，有关LDLR基因突变的争辩报道已经证明并显示其与家族性高胆固醇血症、AS之间明确的因果关系，同时近期争辩觉察AS病人基因启动子区甲基化程度增高,提示在LDLR基因调控区的高甲基化修饰可能参与了AS的发病12。但有关LDLR基因启动子区的甲基化修饰在缺血性脑卒中病人是否消灭特别、及其与缺血性脑卒中的关系争辩却迄今未见报道。缺血性脑卒中是在动脉粥样硬化根底上，当不稳定斑块裂开，伴随凝血/纤溶系统的失衡，表现为凝血功能的上升，纤溶功能的下降，局部血栓形成。血栓调整蛋白(thrombomodulin,TM)是近年来新觉察的存在于血管内皮细胞外

11、表的糖蛋白，作为凝血酶的受体，它参与蛋白C (PC)活化，在调控血栓形成及溶解中发挥重要作用，此外，它还能降解纤溶酶原激活物抑制剂，促进纤溶，越来越多的争辩说明，动脉粥样斑块的发生、形成及消退等与血栓、凝血系统亲热相关，TM通过结合凝血酶，可以对抗由其损伤内皮引起的促动脉粥样硬化(AS)作用，因此，作为内皮细胞的保护因子之一，且具有抗血栓形成功能的TM在AS中的作用令人关注。TM水平表达变化被觉察与脑梗死发生有亲热关系。争辩觉察急性脑梗死的病人血浆TM浓度与脑梗死的严峻度呈负相关，1月后的恢复期血浆TM浓度较急性期显著上升13。而老年人腔隙性脑梗死和缺血性白质疏松血浆TM显著增高血清中TM的浓

12、度检测有助病人的早期诊断和病情动态观看14。国内一些争辩也说明与凝血功能有关的血清标记物的升高增加了脑血管疾病发病危急，TM与高血压一样是脑血管疾病独立危急因素15。近年来TM基因多个位点的变异与脑血管病的关系也有较多的报道。有争辩觉察TM分子中Ala25Thr的突变与血栓性疾病和心脑血管疾病有关，是动静脉血栓危急因素16。然而，也有争辩显示Ala 25Thr位点变异并非脑血管病主要危急因素17。另有争辩觉察C1418T等位基因变异是卒中的潜在危急，虽然C1418T等位基因变异在亚洲人群较为普遍，但前者与亚洲人群中脑血管病及血栓形成之间的关系目前还不明确18。其他争辩觉察与脑血管病有关的变异包

13、括：G21748C位点突变导致SPJ反响元件与结合部位不相全都，致使TM的转录发生转变；G2U66A突变转变了 SSRE的核心结合序列而导致内皮细胞功能特别，从而增加血栓形成风险。但最近有争辩报道TM的G1748C、1208-1209 delTT C1418T这三种常见的基因变异与脑梗死的发病率、卒中后5年的总死亡率及血浆中TM浓度的关系均无相关19。由此可见,目前对TM的基因变异与脑血管病的准确关系国内外尚无统一的结论。近来争辩觉察，TM表达的上调同样会受到多方面的调控，其中基因启动子区的CpG岛的去甲基化可能是TM基因转录的最重要的调控方式之一20。大局部状况下，人类疾病有半数缘由与基因遗

14、传有关，另一半则取决于基因组外遗传变化，这种基因组外遗传变化是在不转变遗传信息一DNA序列的状况下，但基因表达却发生了可遗传的变化，这种转变是细胞内除了遗传信息以外的其它可遗传物质发生转变，并最终导致了表型的变化，被称为表观遗传学(epigenetics),从根本上讲，表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果。这种遗传方式的转变主要通过DNA甲基化 和组蛋白的修饰来调控基因表达，其中DNA甲基化修饰是最早觉察的、最常见的DNA修饰方式之一。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。真核生物中甲基化仅发生于胞喀咤。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移

15、酶(DNMTs)的作 用下使CpG二核甘酸5”端的胞喀咤转变为5”甲基胞喀咤。这种DNA修饰方式并没有转变基因序列,但是它调控了基因的表达21。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化 状态；去甲基化状态和高度甲基化状态。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞喀咤能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。安康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通 常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保存22。甲基化可抑制基因的表达，而去甲基化则可表现出基因的活泼。正常状况下CpG岛通常是以非甲基化形式存在于基因的启动子内，但在某些病理条件下或外界因素影响下，基因启动子的去甲基化会使基因转录增加。如王丽珍等23 争辩觉察，高Hey可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化，提高MTHFRmRNA的表达水平。虽然对DNA甲基化的争辩主要集中在肿瘤方面，但近年来表观遗传学，尤其是DNA甲基化修饰在心脑血管疾病（尤其是动脉硬化）中的重要作用渐渐被重视。有争辩觉察动脉粥样硬化形成过