临床血脂测定的方法学与标准化进展.docx

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1、临床血脂测定的方法学与标准化进展中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医院检验科鄢盛恺北京医院卫生部临床检验中心陈文祥血脂测定标准化并非要求统一测定方法，而是要求实验室测定结果达到所制定的技术目标。心脑血管病的临床和流行病学研究，高脂血症的诊断或治疗过程中血脂变化的监测，以及冠心病危险性的估计都需要准确、精密和实验间可比的测定结果。因此脂类测定标准化十分重要。下面对于我国该项技术现状的描述正确的是A.目前全国的脂类标准化工作收到广泛重视，并有条不紊的全面开展起来B.现在我国已有数家实验室被美国CDC接纳为CRMLN成员C.卫生部老年医学研究所提出了一个用高效液相色谱法测定胆固醇的参考方法，其

2、各项技术指标均达到参考方法的要求，而且操作比ALBK法更容易掌握众多研究表明，血脂测定不仅对于高脂血症的诊断及冠心病的危险评估和防治具有重要意义，而且已经应用于其他诸多临床相关专业疾病的研究中华医学会检验分会针对临床血清总胆固醇（TC）、廿油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白A I和B （apoAI和apoB）和脂蛋白（a） Lp（a）的测定方法与临床应用等实际工作中出现的问题，制定发表了关于临床血脂测定的建议文件冏，对于进步规范我国临床血脂测定工作，保证测定结果的准确性与合理应用有着重要意义。近年来，临床血脂测定的方法学与标准化是血脂异常

3、防治领域广受关注的热点之一06。一、血脂测定的方法学1 .TC测定血清TC测定一般可分为化学法和酶法两大类。化学法多包括抽提、皂化、毛地黄皂昔沉淀纯化和显色比色4个阶段。其中ALBK法为目前国际上通用的参考方法。由卫生部北京老年医学研究所生化室建立的高效液相层析法（HPLC）也推荐作为我国TC测定的参考方法。化学法曾在很长一段时间被临床常规使用，但由于操作复杂，干扰因素多，现基本不用，而由随法代替。目前国内建议酶法如胆固醇氧化酶-过氧化物酶-4氨基安替比林和酚法（CHOD-PAP法）作为临床实验室测定血清TC的常规方法网。2 .TG测定血清的TG含量测定大致可分为化学法和酶法两类。目前尚无公认

4、的TG测定的参考方法，二氯甲烷-硅酸-变色酸法（VanHandel-Caslson法）是美国疾病预防与控制中心（CDC）测定TG采用的参考方法，也为美国胆固醇教育计划（ NCEP）所推荐。由卫生部北京老年医学研究所生化室建立的HPLC测定总甘油和游离甘油的方法拟推荐作为我国TG测定的参考方法。酶法测定血清TG的主要优点是操作简便，适合自动分析，线性范围较宽，并且灵敏、精密、相对特异性亦较好，因而目前几乎所有临床实验室均采用此法作为TG测定的常规方法。目前国内建议甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法（GPO-PAP法）作为临床实险室测定血清TG的常规方法。一般临床实验室可采用一步G

5、PO-PAP法，有条件的实验室（如三级以上医院）应考虑开展游离甘油的测定或采用两步防法。3 .HDL-C 测定超速离心结合ALBK法为HDL-C测定的参考方法。硫酸葡聚糖镁沉淀法（DS法）结合ALBK法被美国胆固酶参考方法实验室网络（CRMLN）作为指定比较方法（DCM法）。中华医学会检验分会曾推荐使用磷锯酸镁沉淀法（PTA-Mg2+法），但此法的主要缺点是标本需预先离心处理，结果易受高TG影响。目前国内建议用直接匀相测定法（homogeneous method）作为临床实验室测定血清HDL-C的常规方法。可供选择的方法主要有：清除法（Clearance method ）包括反应促进剂-过氧化

6、物随清除法（SPD法）和过氧化氢酶清除法（CAT法），PEG修饰酶法（PEGME法），选择性抑制法（PPD法），免疫分离法（IS法）包括PEG/抗体包裹法（IRC法）和抗体免疫分离法（AB法）团。4 .LDL-C 测定超速离心结合ALBK法为LDL-C测定的参考方法。国外以往常采用Friedewald公式计算，即LDL-C=TC（HDL-C（TG2.2 （以 mmol/L 计）。但当血清中存在 CM；血清 TG 水平（4.52mmolL（400mgdl）时；血清中存在异常（脂蛋白时（III型高脂蛋白血症）不宜采用此公式。中华医学会检验学会曾推荐使用聚乙烯硫酸沉淀法（PVS法）作为LDL-C测定

7、的常规方法，但此法的主要缺点是标本需预先离心处理，结果易受高TG影响。目前国内外都建议用匀相测定法作为临床实验室测定血清LDL-C的常规方法。可供选择的方法主要有：表面活性剂清除法（SUR法），过氧化氢酶清除法（CAT法），可溶性反应法（SOL法），保护性试剂法（PRO法）和杯芳燃法（CAL法）【刀。5 .Lp（a）测定目前尚无公认的血清Lp（a）测定的参考方法。临床实验室测定血清Lp（a）的方法多为免疫学方法，主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫浊度法包括免疫散射比浊法（INA）和免疫透射比浊法（ITA）等。目前国内建议免疫浊度法作为临床实验室测定血清Lp（a）的常规方法。试剂所用抗体

8、应为多克隆抗体或混合数株识别apo（a）上不同抗原位点的单克隆抗体。首选ITA法，其次为INA法网。此外，设法测定血浆Lp（a）中胆固醇Lp（a）-C的方法，可避免或减少因为apo（a）多态性不同所造成的Lp（a）定量的不准确性。测定方法有超速离心法、麦胚血凝素法和琼脂糖凝胶电泳法,后两种方法在临床应用较多。6 .apoA I 和 apoB 测定目前尚无公认的血清apoAI和apoB测定的参考方法。临床实验室早期多采用火箭电泳（附图）测定血清中apoAI、apoB的含量，以后相继出现ELISA及免疫浊度法，其中以ITA法最为常用。国内建议免疫浊度法作为临床实验室测定血清apoA I、apoB的

9、常规方法，首选ITA法，其次为INA法网。二、血脂测定的参考系统血脂测定的标准化要求实验室之间的血脂测定结果具有可比性，达到规定的准确度，标准化工作的核心是量值溯源。即在建立一个可靠的参考系统作为准确性的前提下，通过标准化计划将准确性转移到临床常规测定中去，使常规测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来网。目前美国已建立较完整的TC、TG测定的参考系统15。其决定性方法都是由美国国家标准与技术研究所（NIST）建立的核素稀释-质谱法（ID-MS法），级参考物质分别为NIST的SRM911b和SRM1595（三软脂酸甘油酯），参考方法分别为CDC改进并维持的ALBK法和二氯甲烷-硅酸-变色

10、酸显色法，二级参考物质有NIST的SRM909、SRM1951a CAP RM026及CDC的多种冰冻血清。ALBK法除用于TC测定外，也用于HDL-C和LDL-C参考方法中的各组分胆固醇测定。与CRMLN成员不同，欧洲部分国家则使用ID-MS法作为胆固醇和TG （总甘油）测定的参考方法。由于TG测定中的变色酸显色反应步骤多、需要强酸试剂，最近CRMLN拟将此步（廿油测定）改为酶法。HDL-C、LDL-C目前暂没有决定性方法和一级参考物质，只有参考方法和二级参考物质，参考方法为超速离心结合ALBK法，二级参考物质为CDC冰冻血清、NISTSRM1951a及CAPRM026。鉴于此参考方法所需血

11、量大、操作复杂、影响因素多，CDC也在考虑进行改进与完善。apoA I . apoB和Lp（a）测定的标准化问题非常复杂，也是目前国际上比较关注的问题阿】。1989年国际临床化学与分子生物学联合会（IFCC）就成立了以美国西北脂类研究室（NWLRL）牵头的载脂蛋白测定标准化委员会，主要致力于apoAI和apoB参考物质SP1-01 （冻干血清）、SP3-07 （冰冻血清）的研究。apoA I、apoB和Lp（a）目前尚无公认的决定性方法与参考方法，仅CDC建立了 个apoA I测定的HPLC-MS候选决定性方法。IFCC T 1995年和1998年连续成立了 2届Lp（a）测定标准化工作组WG

12、Lp（a）,主要工作是制备Lp（a）的推荐（二级）参考物质Lp（a）PRM-SRM 2B,现已被世界卫生组织（WHO）认可与接受。SP1-01. SP3-07和SRM2B的定值方法为CDC的放射免疫分析法、NWLRL的INA法和ELISA ,定值分别为1.500.08gL E220.02gL和107.18.6 nmolL,定值所用校准物（一级参考物质）为欧共体标准局（BCR）认证参考物质CRM393 （纯化apoA I ）、密度d为1.03-1.05的纯化LDL和2份纯化Lp（a）。2004年IFCC又成立了由5名专家组成的载脂蛋白参考方法工作组（WG-MA）,主要工作是与CDC合作共同建立载

13、脂蛋白测定的参考方法。对WHO-IFCC apoA I、apoB测定的二级血清参考物质（SSRMs）的标准化计划给予联合分析支持。目前主要是建立apoA I、apoB测定的WHO-IFCC第国际参考试剂库。这些试剂库在0C储存。再则根据美国国家实验室标准化委员会（NCCLS）导则制备新的apoB参考物质SP3-80表1为目前国内外公认的血脂、脂蛋白和载脂蛋白分析的参考系统。表1血脂、脂蛋白和载脂蛋白测定的参考系统项目决定性方法1。级参考材料参考方法2。级参考材料TCID-MS 法(NIST)纯胆固醇NIST SRM911b我国 GBW09203aALBK 法(CDC)HPLC法(我国)C DC

14、冰冻血清NISTSRM909SRM1951aCAP RM026我国 GBW09138TGID-MS 法(NIST)三软脂酸酯NIST SRM1595二氯甲烷/硅酸/变色酸法（CDC）（NCEP推荐）CDC冰冻血清NISTSRM1951aCAP RM026HDL-C暂无暂无超速离心/肝素Mn2+ALBK 法（CDC）（NCEP 推荐）CDC冰冻血清NISTSRM1951aCAP RM 026LDL-C暂无暂无定量法（CDC）（NCEP推荐）CDC冰冻血清NISTSRM1951aCAP RM026apoA IHPLC-MS(CDC候选)纯化的apoA IBCR CRM393暂无WHO参考血清SP1

15、-01CDC用RIA法为对比方法定值apoB暂无超离心纯化的LDL(d1.030-1.050)暂无WHO参考血清SP3-07NWLRL用INA法为对比方法定值Lp(a)暂无2份超离心纯化Lp（a）暂无SRM2BNWLRLffl ELISA法为对比方法定值注：CAP为美国病理家学会血脂测定标准化并非要求统一测定方法，而是要求实验室测定结果达到所制定的技术目标。对于TC、TG、HDL-C和LDL-C四项，目前国内外要求不精密度（用变异系数CV表示）应分别不大于3%、5%、4%和4%,不准确度（用偏差表示）应尽量分别不大于3%、5%、5%和:t4%,总误差应分别不大于9%、15%、13%和12%。总误差=偏差+1.96CV （与参考血清的靶值比较）。对于apoA I、apoB和Lp（a）三项，目前国际上还没有明确的要求，国内建议不精密度应分别不大于3%、3%和4%,不准确度应分别不大于5%、5%和土10%网。三、血脂测定的标准化计划标准化