HPLC分析方法开发：分离度的认识与思考.docx

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1、HP1C分析方法开发：分离度的认识与思考对于色谱工作者而言，面对复杂成分的检测，分离是首要的关注点。无法有效分离意味着无法进行准确的定性、定量检测。中国药典通则0500色谱法规定，高效液相色谱法、离子色谱法及气相色谱法等要求“除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5一、什么是基线分离？基线分离是每一个色谱分离工作者在兼顾效率前提下的终极追求。理论上，当分离度等于1.5时，即可认为达到了基线分离。为什么是“即可认为”，而不是绝对认为呢？这里面涉及到正态分布/高斯分布，30,6。等概念。这些概念稍显顽固，我们给予记过并留待察看，暂不深入追究。用点色谱参数里常用的名词，再加

2、一点通俗语言来说就是，对称因子为1O的两个高矮胖瘦一模一样的色谱峰，当分离度为15时可认为是基线分离。比如，下图1显示的某药典给出的示例图。但是，理论指导实践，实践是检验真理的唯一标准。比如说，上面对于基线分离的描述情形，在实际工作中基本不可能，而且说“基本”是为了满足“一切皆有可能”的严谨，否则可以直接说“根本不可能”。因为德国哲学家莱布尼茨说，世界上没有完全相同的两片树叶，而每一个色谱工作者都可以说，世上没有完全相同的两个色谱峰。实际情况是，往往相邻色谱峰各有千秋，导致同一个分离度会出现完全不同的分离效果。比如下图2,两个不同比例的色谱峰，在不同分离度情况下的分离表现，在分离度0.6时尤为

3、明显：当后峰是前峰的1/16时，还能看出是两个峰吗？图2分离度及谱峰相对大小（面积）与分离度关系实用高效液相色谱法的建立既然如此，那我们就不要再执念于分离度1.5了，也不要自欺欺人的出具一个显示分离度大于15的色谱报告而不看实际分离效果了。二、分离度如何定？很多人都做过仿制药、改良型新药，甚至创新药！99.9%的核心技术思想离不开模仿、借鉴，还有0.1%留给那些从0到1的“传说”。下表1列举了从中国药典以及欧洲药典中随机摘录了一些典型的实例，对于分离要求可以说是“五花八门”。表1不同品种对于分离度的要求举例来源品种名称分离度要求中国药典乙酰谷酰胺乙酰谷酰胺峰与谷发酰胺峰之间的分离度应大J-7.

4、0己I1H可可碱茶碱峰与咖啡因峰的分离度应大F4,咖啡因峰与已雨可可碱峰的分禺度应大J10.0o马来酸依那普利马来酸峰与杂质I峰之间的分离度应符合要求（1.5）,杂质I峰、依那普利峰与杂质峰之间的分离度应大于4.0o欧洲药典BETAMETHASONEACETATE醋酸值他米松minimum3.3betweenthepeaksduetobetamethasoneacetateaudimpurityB。懵酸但他米松峰与杂质B峰分离度应大于3.3。BETAMETHASONEVA1ERATE戊酸但他米松minimum1.7behveenthepeaksduetoimpuritiesHandD.杂质H与

5、杂质D分离度应大于1.7。BROMOCRIPTINEMESI1ATE甲磺酸浜隐亭minimum1.1betweenthepeaksduetoimpuritiesAandB.杂质A与杂旗B分离度应大F1.1C1opidogre1HYDROGENSU1FATE硫酸气氯比格雷peak-to-va11eyratio:minimum10.whereHp=Iieig1itabovethebase1ineofthepeakduetoimpurityBandHv=heightabovethebase1ineofthe1owestpointofthecurveSeDaratinRthispeakfromthep

6、eakduetoC1opidogre1.峰谷比:杂质B峰与氯叱格雷峰之间的峰谷比应大J10.0如果说中国药典中的例子还算中规中矩的拓宽了我们对分离度15的认识，那欧洲药典分离度33、1.7、1.1是什么操作？这种有零儿有整儿的分离度是怎么搞出来的儿？峰谷比又是什么操作，跟分离度有什么区别，我该怎么选？看完以后什么感觉？眼花缭乱，再加上点眩晕，有点上头！带着一脑门儿的问号，总感觉，法典里透着点草率，严谨中不失那么点随意。要不是看在欧洲药典的面子上，领导不得骂的你找不着北？既然欧洲药典都可以这么干，那我们能不能也模仿、借鉴一下？能！大写的。而且，在这个彰显个性，鼓励创新的时代里，建议不要做分离度1

7、.1、3.3这种纯仿制，也不要假模假式的做一些分离度1.2、3.4这种me-too,可以尝试做一些分离度2.2、4.4这种me-better,或者大胆一点做一些分离度1.03、2.21这种四不像。三、如何证明合理性？实际工作中也接触到不少人有这个想法：当分离度连中国药典那除另有规定外的15都达不到时，开始动了定分离度1.0、1.2的心思。但往往只是大笔一挥而已！比如，方法开发及方法验证时实际分离度为14,为了日后方法系统适用性通过性的保险起见,怀着一丝的忐忑，带着欧洲药典的一丝安慰，标准制定时写下了1.2,大胆一点的直接来个1.0。合理吗？有人说之所以定了1.2,是来源于耐用性验证时在某条件下

8、的最差分离度。暂且不去推测该耐用性试验是如何设计的，但我相信大多数情况下对于制定1.2分离度的证明性是不够的。当然，不仅是达不到分离度1.5时的退让，更有很多达到15后的前进，比如分离度应大于10.0。这些数值的制定不仅仅是一个耐用性的探索，更不是冒险或保守之类的估计，而是需要具体的试验设计去验证。方法学验证设计（针对分离度或峰谷比制定）简述如下（如有遗漏谬误还请自行脑补修正，朝着目标前进）：1、拟定分析方法耐用性的关键参数：碳酸钱溶液浓度、流速、柱温、色谱柱及仪器。2、拟定关键耐用性参数在日常检测中可能出现的偏离，比如碳酸镂溶液浓度由于配制过程导致的误差，由于仪器本身性能导致的流速及柱温控制

9、差异，色谱柱批次间的差异，不同仪器（型号、品牌）之间的差异。这些差异均可以根据经验及相关的性能确认（PQ）进行预先估计，在估计的基础上适当放宽考察。3、在上述各种拟定的偏离条件下进行分离度考察，确定最差分离度，比如说是在流速2.2m1min时分离度为最差的1.1。4、在流速2.2m1min,分离度为1.1的条件下，设计杂质A与杂质B的灵敏度（检测限、定量限），线性与范围，准确度（加标回收）试验。此时，我们甚至可以在该条件下兼顾其他杂质的再次验证。5、在最差分离度条件下，各项验证均满足拟定的验证要求时（不一定非得完全按照中国药典9101的要求），可以合理的制定所希望的分离度或峰谷比。此外，尚需说明一点的是,耐用性不是通过性验证,无需拟定范围后追求耐用性试验的通过。耐用性的参数应在方法开发阶段己完成边界的探索，并进行了初步的验证；在方法学验证阶段根据开发时的边界，适当调整符合实际使用场景的参数偏离范围并进一步的确认。因此，需要根据具体情况，在参数调整后设计不同程度的耐用性验证试验，并没有一个SOP似的参考模板，这是该项验证与其他验证项目最大的不同，也是我们制定非常规要求分离度（比如分离度1.0,10.0,峰谷比5.0等）的基础。