纯化水方法学确认.docx

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1、目录一、引言1、概述2、验证的目的二、验证方法合格标准三、主要材料确认1、仪器设备确认2、辅助材料确认3、人员确认4、商品培养基及灭菌培养基确认5、菌种及菌液的制备四、样品制备1、稀释液2、供试液制备3、操作方法五、方法验证1、需氧菌总数的计数方法验证2、计算菌回收率公式六、验证结果及评价七、再验证周期八、验证结论批准一、引言1、概述：根据中国药典2015年版三部通则“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（以下简称药典）的要求，对内控标准中有“微生物限度”检查项的产品进行该项验证。根据中国药典2015年版三部纯化水进行方法学确认。2、验证目的：确保药品微生物限度检查实验的准确性，在

2、建立药品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌总数计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该样品的需氧菌总数的测定。二、验证方法合格标准1 .前提条件：培养基适用性实验应符合规定，即：被检R2A培养基上菌落平均数与对照培养基上菌落平均数比值应为0.52,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。2 .计数方法适用性试验：在3次独立的平行试验中，若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组的平均菌落数的比值）均在0.52范围内，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的需氧菌总数。三、主要材料确认1、仪器、设备确认名称型号存潮点厂家工作状态校验期至培养箱(3OC5C

3、)HPS-400118室南京实验仪器厂立式压力蒸汽灭菌器1dzx-IOOKBS116室上海申安医疗器械厂生物安全柜Bsc-IIOOIIB2阳性室北京东联哈尔仪器制造有限公司冰箱HY-S13-03116室北京低温设备厂热空气消毒箱GX625E116室天津市泰斯特仪器有限公司检查结果:检查人：复核人：日期:2、辅助材料确认2.1 移液器、接种环、酒精灯、记号笔、酒精棉球、试管架、试管、玻璃平皿、止血钳等2.2 需灭菌物品见微生物限度检查法验证记录2.3 一次性无菌用具见下表无菌备品的检查备品名称批号有效期包装情况薄膜过滤器无热原吸头无菌橡胶医用手套检查结果:检查人：复核人：日期：3、人员确认化验员

4、经设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，考核合格后上岗。4、商品培养基及灭菌培养基4.1 所用培养基均不得有结块、吸潮、异味、颜色发生改变等现象。培养基检查结果，如下品名批号储藏条件有效期生产厂家胰酪大豆陈琼脂培养基阴凉干燥处三年R2A琼脂培养基阴凉干燥处三年检查结果:检查人：复核人：日期：4.2 已灭菌培养基的检查结果及结论见微生物限度检查法验证记录。5、菌种及菌液的制备5.1菌种来源：黑龙江省药检所、公司收集的制药用水系统中的菌落。菌种确认菌种名称传代日期代数管号传代人形态确认铜绿假单胞菌年月曰枯草芽抱杆菌年月曰水系统环境菌（冻干三）取用一周内该车间水系统环境菌水系统环境菌

5、（冻干二）取用一周内该车间水系统环境菌水系统环境菌（固体车间）取用一周内该车间水系统环境菌5.2菌液的制备分取铜绿假单胞菌、枯草芽他杆菌、水系统环境菌（冻干三）、水系统环境菌（冻干二）、水系统环境菌（固体车间）的新鲜培养物少许接种至胰酪大豆陈琼脂培养基上（环境菌应预先用胰酪大豆月东琼脂培养基平板增菌），3035C培养1824小时；上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液制成每Im1含菌数小于IOOCfU的菌悬液。菌悬液制备后在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28可在24h内使用。5.2.1阴性对照：菌液制备时应进行2个平板或试管的阴性对照试验，以确认菌种制备有效。5.3菌液菌落数：

6、详见微生物限度检查法验证记录四、样品制备1稀释液：氯化钠-蛋白陈缓冲液。2供试液制备：薄膜过滤法取本品ImI加氯化钠-蛋白陈缓冲液至IOOm1混匀。3操作方法：取上述供试液IOom1按薄膜过滤法过滤，滤完后取出滤膜，菌面朝上贴于己装载冷却凝固的RzA琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。需氧菌总数计数平板倒置于3035C培养箱培养5天。五、方法验证1 .培养基适用性试验及有效期考察1.1 R2A琼脂培养基制备基础方法：取18.124g,加水1000m1,微温溶解后，装入4个250m1三角瓶。使用量较大时，按照验证的装载方式及灭菌程序，在其限定内调整单次灭菌量。可能的装载方式：801灭菌锅250m

7、1*10瓶*3层或者500m1*7瓶*3层IOO1灭菌锅250m1*22瓶*2层或者500m1*15瓶*2层灭菌条件为:121、0.1MPa,15mino含第7日、14日、21日的有效期考察，每次适用性试验需要使用600m1；共需3次。1.1.1 对照培养基的制备：取对照培养基一袋，加水300m1,微温溶解，装入相同容积三角瓶中，与被检培养基相同条件同时灭菌。1.2 接种上述5种菌株至待测R2A琼脂培养基平板（每个平板中含培养基1520mD,每个菌株平行制备2个平板；同样方法接种上述菌株至对照培养基。培养温度3O35C,时间不超过3天。被检培养基上每种菌株的平均菌落数与对照培养基上的平均菌落数

8、比值应在0.5-2,且菌落形态大小与对照培养基一致。1.3 在第7日、14日和21日按1.2方法使用1.1配制的R2A琼脂培养基，及新制备的对照培养基进行培养基适用性检查。稳定性及有效期考察表次数比值（0.52）及性状一致性铜绿枯草冻干二菌落冻干三菌落固体菌落第一次第二次第三次结论：评价人：评价日期:2需氧菌总数的计数方法验证2.1 设置试验组、菌液对照组、供试品对照组，分别取三个不同日期的供试品（选择储罐取样点）进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。试验菌液为铜绿假单胞菌、枯草芽泡杆菌。（1）试验组取上述供试液IoOm1,分别加入含菌数不大于IOOCfU/m1的试验菌液

9、1m1,按薄膜过滤法过滤。过滤完毕后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的RzA琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。（2）菌液对照组取上述供试液IOOm1,加入氯化钠.蛋白陈缓冲液1m1,按薄膜过滤法过滤。过滤完毕后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。（3）供试品对照组取氯化钠-蛋白膝缓冲液IOOm1分别加入含菌数不大于IoOCfU/m1的试验菌液1m1,按薄膜过滤法过滤。过滤完毕后取出滤膜，菌面朝上贴于已装载冷却凝固的RzA琼脂培养基平板上，平行制备两个平皿。2.2 上述实验三个纯化水车间（冻干粉针二车间、冻干粉针三车间、口服固体制剂车间）同步进行

10、，可使用同一组阴性对照；培养温度3O35C,时间不超过3天。各组实验检查结果及结论见检验记录。2.2.1 需要主要材料：、已灭菌R2A琼脂培养基720m1、薄膜过滤器36套。2.3 计算菌回收率公式：试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数菌液对照组的平均菌落数计数方法适用性表次数回收率比值（冻干二）铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌第一次第二次第三次次数回收率比值（冻干三）铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌第一次第二次第三次次数回收率比值（固体）铜绿假单胞菌枯草芽狗杆菌第一次第二次第三次结论：评价人：评价日期：3.供试品检查3.1 每个车间三批样品（同一个点、不同日期，减少随机误差，便于统计分析），按上述验证的

11、方法检验，即取水样1m1,加氯化钠.蛋白陈缓冲液稀释至IOom1,取该IOomI溶液进行薄膜过滤，取滤片，菌面向上，贴于R2A琼脂培养基平板；平行制备两个平板，同法以氯化钠-蛋白陈缓冲液代替样品进行阴性对照试验：将上述平板于3O35C培养不少于5天；阴性对照不得有菌生长（同时检验的各批产品可使用一个阴性对照平板）且三批检验均应能获得准确结果。3.2 每日主要材料：已灭菌R2A琼脂培养基200m1,薄膜过滤器10套。3.3检验结果次数日期车间冻干二冻干三固体第一次月日第二次月口第三次月口结论:评价人：评价日期:六、验证结果及评价：方案实施人员是否经过相关技术培训或路演口;实施前仪器设备操作及人员

12、能力确认是否有效口;实施前相关校准、检定及标准物质、关键耗材准备是否充分口;实施项目是否完整、正确口;实施过程是否未曾发生偏差、变更或其它异常口;需要说明的情况:评价人:评价日期:七、再验证周期:需要进行本次再确认的情况主要有：纯化水生产工艺变更、检验培养基供应商变更、检验用薄膜过滤器的形式变更；检验人员的不稳定因素；若有其他可能影响计数准确性的变更应考虑实施本确认。否则，本确认再验证周期为5年。八、验证结论批准:验证小组:日期：附件一：微生物限度检查法验证记录微生物限度检查法验证记录品名：纯化水取样口：来源:1.实验室环境环境微生物限度室阳性对照室压差（Pa）温度（）湿度（%）沉降菌（CfU

13、）检查结果：检查人：口期:2.灭菌物品确认灭菌物品灭菌方式温度时间日期无菌服、口罩湿热平皿、量筒干热检查结果：检查人：日期:3 .灭菌后培养基的确认3.1 灭菌后培养基瓶和塞子不得有破裂，避免形成气泡，培养基应呈均匀溶液状态，不得有析出沉淀，PH值不能超过规定值的0.2,不得污染微生物。促生长能力符合规定。己配制灭菌培养基在有效期内，如下表所示：品名灭菌方式灭菌后PH贮藏条件配制日期批号配制人胰酪大豆陈液体培养基湿热R2A琼脂培养基湿热检查结果:检查人：日期：4 .菌液悬液计数结果稀释级菌落计数检查结果标准菌株稀释级/代数计数结果（CfU）铜绿假单胞菌枯草芽抱杆菌水系统环境菌（冻干三）水系统环境菌（冻干二）水系统环境菌（固体）结论：制备人：复核人：日期:5 .需氧菌总数的计数方法验证菌落计数结果组别铜绿假单胞菌（Cfu）枯草芽抱杆菌（CfU）菌落数平均数菌落数平均数试验组菌液对照组供试品对照组试验组菌回收率检验结果:检验人:复核人:口期:附件二：纯化水微生物限度检验记录品名样品来源车间湿度