最新：多重即时检测技术在传染病诊断中的研究进展.docx

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1、最新：多重即时检测技术在传染病诊断中的研究进展摘要快速、准确的诊断技术能有效防控传染病传播,遏制疫情发展。多重即时检测（X-POCT）技术可有效避免单一目标检测的局限性，实现多种传染性疾病的快速筛查和及时防控。该文总结X-POCT在传染性疾病及其病原体诊断中的应用，包括针对不同靶标的X-POCT检测方法，重点阐述了微流控芯片、纸基与微滴体系等设备平台，并探讨了本领域现存挑战与未来发展方向，以及X-POCT在基于全健康理念的高效传染病防控网络中的应用前景。传染病是由病原体引起，能在人与人、动物与动物以及人与动物之间相互传染的疾病总称，具有传染性强、病死率高、危害范围广等特点1o在全球范围内，尤其

2、是中低收入国家，传染病是危害人类健康的最主要疾病，给全球经济、社会稳定和公共卫生带来重大负担20以2019年底暴发的新型冠状病毒感染为例，截至2023年2月18日，全球累计确诊病例4.1亿余例,死亡病例580万余例，造成千亿级的经济损失3,给全球带来了严重灾难。快速、准确地诊断传染病可有效预防传染性病原体的进一步传播，遏制其进一步暴发及带来的健康危害。目前传统传染性病原体诊断方法,如PCR、酶联免疫吸附剂测定enzyme1inkedimmunosorbentassay,E1ISA)等，多依赖于专业的设备与技术人员，难以在资源匮乏地区实现传染性病原体的快速原位诊断。即时检测(point-of-c

3、aretesting,POCT)指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的检测方式41与传统方法相比，POeT具有检测结果显示快速、操作流程自动化、检测设备集成化等优点5o因此，POCT有望在资源匮乏环境实现传染性病原体的快速、准确检测。随着技术发展，POCT已逐渐用于传染病及其病原体的即时诊断，常见技术包括基于纸基6、微流控7以及微滴体系8等的诊断方法。其中,多重即时检测(mu1tip1exedpoint-of-caretesting,x-POCT)是近年来的研究热点。x-POCT是指对单个样本中不同靶标的同时现场检测,能有效避免单一标志物检测所带来的误诊、漏诊等问题

4、，在快速检测基础上进一步提高传染病诊断的灵敏度与特异性，为及时高效防控提供重要依据90本文总结近期x-POCT在传染性疾病及其病原体诊断中的应用，包括针对不同靶标(蛋白质、核酸、病原体等)的多重即时检测方法，重点阐述微流控芯片、纸基平台与微滴体系等设备平台，并探讨现存挑战与未来发展方向。一、用于X-PoCT的传染病诊断方法传染病诊断靶标包括蛋白质、核酸与病原体等10o近年来快速发展的生物传感分析方法具有灵敏度高、选择性好、简单、成本低等优点，给传染病靶标快速、便携式检测带来巨大机遇11采用识别元件与靶标分子之间一对多或多对多模式，以及信号输出元件与靶标分子之间多对多的信号转换方式，可进一步实现

5、传染病及其病原体的多重检测。1 .基于蛋白质靶标的X-POCT:蛋白质是传染病诊断的重要靶标之一，其浓度变化可反映出患者的感染程度20o目前，蛋白质靶标的快速检测主要是基于抗体121适配体13识别，借助纳米材料等信号放大增加灵敏度或使用抗干扰系统提高稳定性21,并以光学、电化学信号获取检测信息22oZUPar1eid等12设计了一种低背景、无交叉反应的电化学免疫传感器，实现了全血中3种脓毒症标志物的同时检测。为提升检测灵敏度和稳定性，Zupand记等12在电极表面涂覆1层还原型氧化石墨烯纳米复合物，这种多孔三维网络结构能够有效提升电子传递速率、阻碍电极与非靶标的接触。Saraf等13设计了基于

6、适配体-靶标-适配体比色夹心法的微流控平台，通过银染放大系统，实现了双病毒包膜蛋白的多重、可视化检测。2 .核酸靶标的X-POCT:核酸是病原体的遗传物质。靶向杂交、扩增病原体核酸的特征区域，能实现灵敏、特异地检测。通过设计多个引物并扩增不同病原体的特征区域，即可达到多重检测目的。近年来,等温扩增技术，包括环介导等温扩增技术（1oop-mediatedisotherma1amp1ification,1AMP)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepo1ymeraseamp1ification,RPA)、规律成簇的间隔短回文重复及其相关蛋白系统c1usteredregu1ar1yinte

7、rspacedshortpa1indromicrepeats(CRISPR)andCRISPRassociatedproteins,CRISPR/Cas等，被广泛应用于病原体多重检测。与PCR相比,等温扩增技术无需程序性升降温、操作简单、反应时间短，且与PCR有相当的灵敏度，更适用于即时检测15,16,23,24oSeOk等14运用逆转录1AMP一步法同时检测寨卡、登革热和基孔肯雅3种病毒。在1AMP反应过程中，体系的镁离子浓度发生变化；利用羟基蔡酚蓝，可实现颜色可视化检测。进一步结合纸芯片后，该方法可在102105拷贝范围内实现3种病毒的实时定量检测14o本课题组应用RPA-1AMP串联法可

8、在60min内完成废水中新型冠状病毒不同基因靶点与多种人肠道病原菌的多重检测，灵敏度分别为IXIo2GE/m1和5102CFU/m115o课题组进一步利用Cas12a蛋白酶的反式切割活性，设计了RPA-CRISPR/Cas体系用于同时检测新型冠状病毒的N、S和P基因。该方法用糖膜隔离-再溶解特性,巧妙地解决了RPA和CRISPR体系不兼容的问题。与纸芯片结合后,该方法展现出与常规RT-PCR方法相当的灵敏度和特异性16o3 .病原体的X-POCT:除蛋白质和核酸，传染病诊断也可通过直接检测病原体来实现25病原体的传统检测方法以分离培养与涂片镜检为主，因耗时长、操作复杂而难以实现现场即时检测26

9、o近年来，生物传感方法在病原体快速、多重检测方面展现了巨大的应用前景。1i等26利用金属配位自组装技术合成了具有不同磁性响应和荧光特性的多功能纳米颗粒(f1uorescentmagneticmu1tifunctiona1nanopartic1es,FMNP),随后在其表面共价修饰不同的核酸适配体APt-FMNP探针，成功用于捕获、分离、定量检测大肠杆菌0157:H7和鼠伤寒沙门菌。类似的，Keams等17使用凝集素功能化磁珠捕获和分离样品中的细菌，然后采用菌株特异性抗体功能化的纳米颗粒对细菌进行标记，使用表面增强拉曼散射方法实现了大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的三重检测，灵敏

10、度高达IOCFU/m1。二、传染病诊断的X-PoCT设备平台X-POCT的设备平台主要包括微流控芯片、纸基平台和微滴体系等，具有体积小、简单、便携、快速等特点，为有效防控传染病传播流行提供有力的技术支撑27(表1、21.微流控芯片：微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到微小的芯片上，仅通过皮升或微升体积的微量流体，自动完成生化分析全过程的多学科交叉新技术29o微流控技术具有微型化、集成化、高通量、自动化等优势，为实现传染病及其病原体的多重即时检测提供了快速、便携的技术途第28,290微流控芯片的驱动方式分为机械驱动与非机械驱动32o机械驱动是

11、利用自身部件的运动来达到驱动目的,如离心力驱动和微泵驱动33;非机械驱动方式则主要包括电动驱动（32诉口毛细管作用力驱动34o1in等35研发出由定位中心、进出口孔、微通道、24个缓冲池和24个生物反应器池组成的离心式圆盘，并通过与加热模块、电机、多个运动控制器、微处理器和发光二极管等组成了便携式实时荧光检测仪。该设备可同时检测4种埃博拉病毒，检测限可低至10拷贝1Nguyen等36设计了配有玻璃过滤萃取柱和多个反应腔室的离心式圆盘，其与旋转电机、加热器、荧光光学器件、触摸屏和数据分析软件等组成了便携式分析仪，实现了猫上呼吸道疾病4种病原体的同时检测。通过复杂的微通道和旋转方案设计，在离心式圆

12、盘上完成了样品注入、清洗、洗脱、核酸提取和1AMP/PCR反应的一系列连续操作，整个过程仅耗时90minCiftCi等37则通过非机械驱动方式设计了无泵微流控芯片，通过滴加提取液捕获扩增产物，无需任何加载或洗涤程序。该平台一次性实现了埃博拉病毒、寨卡病毒和登革热病毒的准确诊断。微通道是微流控芯片的核心部分，主要通过热压法、激光切蚀法和三维打印法等制备获得380HUang等39借助激光切蚀法制备出包含A、B两面的多重检测微流控芯片。其中，A面雕刻有用于RPA反应的微观结构,B面雕刻有用于1AMP反应的微观结构。因此，在该芯片上可完成两阶段的等温扩增提高检测灵敏度。经测试该微流控芯片可在60min

13、内完成新型冠状病毒和麻疹病毒的多重检测，检测下限约为10拷贝.然而，激光切蚀法用于制作微通道存在着耗时长、设备贵、难以实现复杂结构个性化加工等局限。近期，三维打印技术逐步在微流控芯片制造方面崭露头角，有效弥补传统加工方法的不足400本课题组建立了一种灵敏的、多路复用的比色检测方法(sensitive-mu1tip1exed-co1orimetricdetection,SMCD)来检测废水样品中的病原体。借助三维打印技术，SMCD方法集微流控芯片上将核酸提取、重组聚合酶等温扩增和环介导等温预扩增和比色检测于一体，可在60min内完成废水中新型冠状病毒多基因靶点与多种人类肠道病原体的多重检测灵敏度

14、分别为1x102GE/m1和5102CFU/m1。此外,SMCD的比色信号报告框嵌入在微流控芯片内，可利用智能手机进行实时记录与分析。这种智能、互联、现场监测策略为快速收集有关传染病的环境动态、传播和持久性的时空流行病学数据提供可能1502.纸基平台：纸是一种轻薄、成本低、多孔的环保材料,广泛应用于生化分析领域410纸基材料在用于构建分析装置时具备以下优势：易于化学修饰和材料固定、具备自发的液储区动能力、可批量生产，以及可实现灵活的流体控制42因此，纸基分析器件，包括侧流层析(Iatera1f1owassays,1FA)和微流控纸基分析装置(microf1uidicpaper-basedana

15、1ytica1devices,PAD),被认为是快速检测装置发展的主流方向，在传染病及其病原体的X-POCT方面得到广泛应用431典型的1FA试纸条由样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫组成,每一部分之间有不同程度的重叠以保证样品流动的连续性。在1FA试纸条上固定修饰识别元件、信号转导元件以及缓冲液等，可实现不同待测物质的X-POCT44,45oBrange1等44在试纸条上绘制了3条重组蛋白的测试线，实现了4种埃博拉病毒的同时检测。该方法进一步结合智能手机应用平台，成功用于收集乌干达地区的病毒监测数据。周晓明课题组开发了针对新型冠状病毒基因E和OrfIab基因的1FA平台，同时结合RT-RPA与C

16、R1SPR/Cas9技术进一步提高检测灵敏度和准确性450研究显示,该平台的检测限为4拷贝/m1,整个样品前处理和检测分析可在60min内完成。进一步将该1FA平台用于64例鼻咽拭子标本的检测，阴性预测符合率100%,阳性预测符合率97.14%o该平台可用于资源匮乏地区新型冠状病毒病或其他传染病的准确、便捷诊断45oPAD是指通过喷蜡打印、激光切割和等离子刻蚀等方法，在滤纸上加工出具有一定结构的亲/疏水维系通道网络及相关分析器件，将多步骤、可视化的分析方法集成到纸上微型实验室的新兴技术，具有方便、简单、快速、成本低和所需试样体积小等优点7,14,16,231例如，Manzanas等46利用切割法制备了比色PAD,实现了新型冠状病毒和流感病毒的同时检