HPLC分离三要素的解读分析.docx

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1、HP1C分离三要素的解读分析摘要本文通过解读分离度RS与塔板数N,保留因子K,选择性之间的关系，为广大读者在方法分离过程中采取的改进策略提供理论依据，便于后期方法优化的开展。色谱理论中，分离度RS公式有多种表达形式，然而笔者认为，包含塔板数N,保留因子K,选择性的表达式最具实践指导意义。图1分离度RS表达公式如图1所示，此公式清晰体现了分离度RS与塔板数N,保留因子K及选择性之间的数学关系。如何利用此公式指导具体的方开发,达到理想的分离效果呢？笔者对此进行简单解读。塔板数N的应用图2：分离度RS与塔板数N之间的关系Efficiency(N)分离度RS与塔板数N之间的关系如图2所示。由图可知，分

2、离度RS与塔板数N在一定区域内近似接近线性关系，随着塔板数N的增加，分离度Rs会一直增加。正是源于此关系,所以寻找高效的色谱柱成为广大色谱工作者改善分离的常用手段。如何挑选高效的色谱柱，我们首先要了解如何估算色谱柱的柱效。色谱柱柱效估算公式如下所示：NQ5001dp1一色谱柱长度(mm),dp颗粒直径(Um)由上述公式可知，柱效N与柱长1成正比，与粒径dp成反比。因此，只要我们在原来色谱柱基础上增加柱长、减小粒径或者同时采取这两方面的措施，均能做到增加柱效。至于增加的比例，则由上述公式可计算。另外，上述公式简化为1/dp后则可用于以比较两根色谱柱是否等效。例如两款色谱柱，分别为4.6*15Om

3、m,3Um和4.6*25Omm,5Um,由公式1/dp可推知，两者1dp=50,因此两款色谱柱可视为等效。目前市面上除了常规全多孔外颗粒色谱柱外，核壳颗粒色谱柱也越来越受到重视，其中一方面就是其出色的柱效。与传统全多孔颗粒色谱柱比较，其柱效往往提高20%以上。根据图1分所揭示的数学关系，我们可利用此公式预判改变柱效N后获得的分离度Rs。例如，某物质在4.6*25Omm,5Um的色谱柱上的分离度为1.0,尝试更换为同款4.6*25Omm,3Um的色谱柱。由公式推算可知，更换后其达到的分离度约为1.3。因此，利用此公式通过对分离度的预判，可避免不必要的试验。保留因子K的应用0050850Z11O.

4、UOqn-OSE图3分离度Rs与保留因子K之间的关系10152025303540Retentionfactor(k)Kfn”分离度Rs与保留因子K之间的关系如图3所示。在讨论分离度Rs与保留因子K之间的关系前，笔者先介绍一下保留因子K的计算公式，如下所示：K=(tR-tO)t,to一死时间，tR溶质保留时间由图3可知，当保留因子K5时，通过改变K值，分离度都能得到极大的改善。当保留因子K210,通过改变K值，分离度得到的改善却极小。因此，方法开发过程中，如果色谱峰的保留因子K5,此时通过改变K值便能有效的改善分离。如果色谱峰的保留因子K210,此时通过改变保留因子K将会收效甚微。因此当保留因子

5、K10时，改变其他参数将会更加有效。如图4案例所示，当K=IO时，二者的分离度为2.07；当K=20时，二者的分离度仅为2.16。虽然二者分离度略有增加，但此时付出的代价却是检测时间的加倍。因此，当K210时，利用K值改善分离度并不是一种明智的举措。图4分离案例：K=IO（上图）与K=20（下图）分离图谱选择性的应用图5分离度Rs与选择性a之间的关系分离度Rs与选择性a之间的关系如图5所示。而选择性a的计算公式如下所示:=k2k1k1一色谱峰1的保留因子，k2一相邻色谱峰2的保留因子由图可知，当选择性IWa2时，分离度Rs已经满足要求,不必再改善分离。所以,选择性a在IWa2的区域才有改善的必

6、要。分离条件对三要素的影响以上部分，我们对分离度RS与塔板数N,保留因子K,选择性a之间的关系进行了论述。那么方法开发过程中，如何改善这三要素呢？通过图6我们可以找到具体的控制措施。图6分离条件对塔板数N,保留因子K,选择性a的影响条件kaNrB-B溶剂（乙靖、甲肿等）温度色谓柱的类型（C1茉基、IK基等）流动相的pH+缓冲液浓度一离子对试剂的浓度色潜柱的长度00他大小00流速00压力一一彳二前移纵射+一主要影响，+一次要影响，一相对影响较小，0没有影响，a-对于可电离的溶质分子来说。由图6可知，塔板数N受影响条件较多，其中色谱柱长度和颗粒大小是影响塔板数N的主要条件，其具体计算公式前文也已经有论述，其他条件对塔板数N的影响相对较小。保留因子K主要影响因素包括有机相比例B%,流动相PH以及离子对试剂浓度。对于不可电离的物质而言，流动相PH以及离子对试剂浓度对保留因子K就不再是主要影响因素。选择性的主要影响因素为溶剂种类、色谱柱类型、流动相PH以及离子对试剂浓度，其他条件影响相对略小。当然有些分离条件对三要素的影响并不是孤立的，比如流动相pH,在改变保留因子K的同时也改变了选择性a。因此，当我们明白分离条件对塔板数N,保留因子K,选择性a的影响大小之后，后期开展工作才会有的放矢，更加高效。