2023液相色谱串联质谱同时检测伏立康唑、泊沙康唑和利奈唑胺血清药物浓度方法学建立.docx

《2023液相色谱串联质谱同时检测伏立康唑、泊沙康唑和利奈唑胺血清药物浓度方法学建立.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2023液相色谱串联质谱同时检测伏立康唑、泊沙康唑和利奈唑胺血清药物浓度方法学建立.docx（12页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、2023液相色谱串联质谱同时检测伏立康嗖.泊沙康理和利奈嘿胺血清药物浓度方法学建立目的建立基于液相色谱串联质谱（1C-MS/MS）同时检测伏立康嘤（VRC）、泊沙康嘤（PCZ）和利奈嗖胺（1NZ）血清药物浓度方法。方法方法学验证。收集2023年6月至12月浙江大学医学院附属第二医院服用伏立康嘤、泊沙康嘤和利奈嗖胺的重症感染患者标本分别为155、44和59例。以利奈嘤胺-2H3为内标，准确称量和配制伏立康嗖、泊沙康嘤和利奈嘤胺工作液，采用ACEPFP色谱柱，梯度洗脱,进行液相色谱质谱分析。质谱分析采用正离子电喷雾离子化多离子反应监测模式（MRM）。根据C1SI中C62-A文件指南和液相色谱质谱临

2、床应用建议指南评价该方法的线性、精密度、最低检测限和回收率等。结果VRC和PCZ线性范围均为0.1010.00mg/1,最低检测限均为0.01mg/1;1NZ线性范围为0.50-50.00mg/1,最低检测限为0.05mg/1,范围内线性良好（，均0.99）oVRC批内变异系数（CV）8.30%,批间C16.99%;PCZ批内G9.78%,批间%798%;1NZ批内C16.14%,批间C17.14%VRCxPCZ和1NZ回收率分别为90.96%103.18%91.84%99.17%f97.04%100.41%血药浓度VReI55例、PCZ44例和1NZ59例。结论本研究成功建立1C-MS/MS

3、法同时检测VRC.PCZ和1NZ血清药物浓度，该方法检测可靠实用，满足临床治疗药物监测（TDM）需求。目前临床上伏立康嗖、泊沙康嗖抗真菌治疗和利奈嗖胺抗阳性菌治疗应用非常普遍，尤其是对危重症患者的抗感染治疗。广谱抗菌药为临床提供新选择同时药物不良反应也不容忽视S21o药物不良反应缺乏特异性的临床表现，时效性及敏感性差的监测指标使抗感染早期的鉴别和治疗更加复杂3,41。通过及时有效地对患者进行血药浓度检测，优化给药方案，对提高抗感染疗效，降低药物不良反应至关重要。药物的结构差异导致每种化合物具有不同的药代动力学特性，血液中药物浓度呈现高度的个体间和个体内的差异性，这种变化的原因是多方面的，包括药

4、物的遗传多态性、药物与药物相互作用、胃肠道吸收的改变、炎症、年龄、体重等15.6,7,8。检测伏立康嘤、泊沙康嘤和利奈嗖胺这3种药物浓度的方法很多,各有其优缺点，其中包括免疫测定9，高效液相色谱-荧光检测口。，11】，高效液相色谱-紫外线检测口2】等。常规检测方法需要繁琐的预处理过程、大量的样本、较长的运行时间，往往不能满足常规临床分析。而国内外研究报道药物浓度检测技术大多集中在单一药物浓度或同类药物浓度，尚未见两种抗真菌药物与一种抗细菌药同时检测用于危重症抗感染的技术。本研究欲搭建一个简便的液相色谱串联质谱（chromatographictandemmassspectrometryf1C-M

5、S/MS）检测，同步、快速、准确地检测伏立康嗖、泊沙康嗖和利奈嗖胺血清药物浓度，适用于重症感染患者联合用药监测，或可提高单一用药患者检测效率，成本低，满足临床治疗药物监测（therapeuticdrugmonitoringzTDM）需求。材料与方法一、样本收集2023年6月至12月浙江大学医学院附属第二医院就诊患者样本，经浙江大学医学院附属第二医院人体研究伦理委员会审核同意使用（1202311）。检测药物浓度血清样本纳入标准为:（1）常规剂量用药；（2）连续服用7d;（3）年龄18周岁。排除标准：（1）药物耐药者；（2）备孕妇女和妊娠妇女；（3）临床信息不完整。二、试剂伏立康理对照品（来源：中

6、国药品生物制品检定所，批号100862-202304,含量:99.8%）;泊沙康嗖对照品（来源:TorontoResearchChemia1,批号:3-J1W-13-1,含量:98%）;利奈理胺对照品（来源IMackIin,批号12204313,含量:99%）;利奈理胺-2H3对照品（来源：ISOREAG,批号:21B035-A1,含量：98%）。甲醇和乙睛均为HP1C级，来自Merck公司；甲酸HP1C级，来自Mack1in公司；实验用水为Mi1Ii-Q超纯水（实验室自制）。三、主要仪器和耗材本研究主要仪器为液相色谱串联质谱系统：高效液相色谱仪ABSCIEXExion1CTM（美国ABSCI

7、EX公司）和三重四极杆质谱仪ABSQEXTRIP1EQUADTM4500MD（美国ABSCIEX公司），其他仪器包括BT125D电子天平（德国Sartorius公司）、1EGENDMICRO21R高速低温离心机（美国Therom公司）、G560E涡旋混合器（美国ScientificIndustries）等;色谱柱为C18-PFP,2.1mm100mm,2.6m（英国ACE公司）o操作软件为Ana1yst和MuItiQuantMD3.0.3（美国ABSCIEX公司）四、标准溶液和内标溶液配制1.标准溶液：精密称取伏立康理标准品、利奈嘤胺标准品和泊沙康嗖标准品，分别以甲醇、甲醇和乙睛适量溶解，混匀

8、后的浓度分别为1.00g1z10.00g/1和1.00g/1母液作为标准溶液冷藏备用。2.内标溶液：取利奈嗖胺-2H3对照品，以甲醇适量溶解，混匀后的浓度为1.00g/1,再以甲醇：乙睛=1：2稀释至2.00mg/1,作为内标对照品储备液，-20C令藏备用,用于3个待测物的含量测定。五、校准曲线采用9个浓度点建立校准曲线，随行1个溶剂空白和1个样本空白（空白加内标），但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。至少7个有效浓度，方法学验证至少评价3条校准曲线。只有合格的校准曲线才能对待测样本进行定量计算。以待测物峰面积与内标峰面积的比值对样本浓度（X）进行最小二乘法线性回归（1/x加权），得校准曲线方

9、程。校准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的准确度偏差应在15%以内,校准曲线最低定量限（IoWer1imitOfqUantifiCation,11OQ）在20%以内。六、样本前处理取501样本（校准曲线、质控及未知样本，空白样本加501的空白基质）至2m1EP管中。所有的样本除了空白样本,加入1.0m1内标储备液，涡旋1min,4离心10min（12000g）,取150I上清液，于96孔板中上机检测。七、液相色谱及质谱条件1色谱条件：流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸甲醇溶液（B）,采用梯度洗脱，流速0.3m1/min;进样量2；柱温40;自动进样器温度4oCo洗脱梯度详见表1。表

10、1色谱洗脱悌度（%）时间(min)流动相B025751.2982.002982.0125753.25752.质谱条件:本研究采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式用于定量分析。气帘气、碰撞气和雾化气分别为30、8和50kPa,喷雾电压为5500V,去溶剂温度为450oCo待测物的质谱采集参数见表2o2待痔愉的矮膏果黛叁敛WX.7(m/)ma(V)ACMS(V)ft(V)出口3(V)SSiJ213251O8Mm)AIO9UWINQ11。40*06143SO8WrHMBm.iIfM413M1miIf10I)mw-MMWaM122922Wa0八、方法学验证根据C1SI中C62-A文件指南13和液

11、相色谱-质谱临床应用建议指南14要求进行方法学验证。1.选择性：采用5个不同来源的血清考察选择性。随机抽取检验科健康体检者和未服用伏立康嘤、泊沙康嘤和利奈嘤胺药物的不同疾病患者常规检测后的剩余血清作为空白血清样本评估待测物检测干扰。血清中的杂质应不干扰待测物伏立康理、泊沙康嘤、利奈嘤胺和内标色谱峰。干扰杂质的响应值应低于待测物最低定量限样本响应值的20%和内标响应值的5%o2.线性范围、11e)Q和最低检测限(IOWerIimitofdeteetiOn,11OD):将伏立康嘤(1.00g/1)和泊沙康喋(1.00g/1)标准溶液分别取401,利奈嗖胺(10.00g/1)取201加入到空白血清中

12、得到曲线最高点，再用空白血清逐级稀释,最终伏立康嘤和泊沙康嘤曲线浓度为0.10,0.20,0.40,0.80,1.00,2.00,4.00,7.00,10.00(mg/1)、利奈嘤胺曲线浓度为0.50,1.00,2.00,4.00,5.00,10.00,20.00,35.00,50.00(mg/1)o由盲样人员平行操作得到伏立康嘤，泊沙康嘤质控品浓度为0.50,2.00和8.00(mg/1)，利奈嘤胺质控品浓度为2.50J0.00和40.00(mg/1)。校准曲线最低点即为11OQo信噪比SN3时,能检测到的样本药物浓度为11ODo3 .精密度：用低浓度质控(Ie)Wqua1itycontro

13、1,1QC)x中浓度质控(mediumqua1itycontro1,MQC高浓度质掇highqua1itycontro1jHQC)3个浓度质控样本考察批内和批间精密度。每个浓度平行进样5份样本，每个批次进样15份质控样本，至少考察2d3个不同批次间的精密度。每一质控浓度的批内和批间变异系数(coefficientofvariation,CV)15%o4 .正确度：采用新建方法对国家卫生健康委临床检验中心EQA计划中的1NZ5份样本和英国1GC实验室EQA样本VRC和PCZ进行检测，实测值与靶值的偏倚在25%以内。5 .回收试验在已知浓度样本中添加3个不同浓度的标准品溶液得到理论值每个样本进行5

14、个平行管检测计算加样回收率,回收率在85%115%以内。6 .溶血与脂血标本基质效应：采用1QC、HQC2个浓度的质控品考察溶血血清和高脂血清的基质效应，正常血清样本中加入2%血细胞，经超声破坏后得到溶血样本；正常血清样本中按15%的比例加入20%中/长链脂肪乳注射液，涡旋混匀后得到高脂血清样本，同一浓度的均值与理论浓度的准确度偏差15%以内。7 .稳定性采用不同浓度的2个临床样本室温放置7h和4。令藏7d,平行3次进样，同一浓度的均值与理论浓度的准确度偏差在15%以内。九、统计学分析方法学验证数据采用Exce1统计分析，用元S表示；药物浓度呈偏态分布，与临床治疗有效率分析采用SPSS24.0

15、和GraphPadPrism8.0.1软件分析,用Mann-WhitneyU检验。双侧检验，P0.05为差异有统计学意义。结果一、液相色谱及质谱条件3种药物的典型色谱图显示利奈唾胺IineZo1id,1NZ)、伏立康嘤(voriconazo1e,VRC)和泊沙康嘤(posaconazo1e,PCZ)保留时间分别为1.2、1.6和2.2min利奈嗖胺T2H3内板1NZ-d3)保留时间为12min,分析时间在3.0min内。各组分分离良好，互不干扰，均无残留1%,详细结果见图1oTime,min7X1叶6X105104恻3X10啕2X101100.0.图1血清样本利奈嘤胺(1NZ)、利奈嗖胺-2H3内标(1NZ-d3)、伏立康嗖(VRC)和泊沙康嘤(PCZ)色谱图二、方法学评价1.选择性：本研究考察了来源于5例不同个体的生物样本,结果表明血清内源性基质不干扰待测物1NZ.VRC.PCZ和内标1NZ-d3,方法具有很好的选择性。2.线性范围、11OQ和11OD:本研