污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查 RT-PCR法编制说明.docx

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1、团体标准污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法（征求意见稿）编制说明一、项目来源根据广西标准化协会关于下达2023年第四十一批团体标准制修订项目计划的通知（桂标协2023140号）文件精神，由南宁壮博生物科技有限公司、广西扬翔股份有限公司、金陵农牧集团有限公司、巨星农牧有限公司、深圳市京基智农时代股份有限公司、济凡生物科技（常州）有限公司、广西农业职业技术大学等单位共同起草的团体标准污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法（项目编号：2023-4102）获批立项。二、项目背景及目的意义农业部关于印发国家高致病性猪蓝耳病防治指导意见（20172023年）的通知指出，各地要加大疫情监测力度，

2、及时准确掌握病原分布和疫情动态，科学评估发生风险，及时发布预警信息。要选择一定数量的养殖场户、屠宰场和交易市场作为固定监测点，持续开展监测。2023年，农业农村部关于印发非洲猪瘟等重大动物疫病分区防控工作方案（试行）的通知指出，强化技术支撑，及时通报和共享动物疫病检测数据和资源信息，推动检测结果互认。完善专家咨询机制，组建大区重大动物疫病防控专家智库，定期组织开展重大动物疫病风险分析评估，研究提出分区防控政策措施建议。猪蓝耳病是常见于家猪和野猪群体间的传染性疾病，因其可通过直接接触在群体之间传染，因此这种疾病的出现对我国的养猪业带来了极大的影响。猪蓝耳病又称猪流行性流产和呼吸综合征。此种疾病传

3、染不但会威胁猪的健康，还会影响母猪的繁殖，造成流行性流产情况的发生。广西开展猪蓝耳病病毒检测，主要进行检测的场所包括猪场种畜场等，其中分布在南宁壮博生物科技有限公司、金陵农牧集团有限公司种畜场、京基智农种畜场、巨星农牧种畜场等场所。2023年7月3日，华南地区某生猪养殖场采集15个养殖单元的污水样品；2023年12月1日，华南地区某生猪养殖场采集2个养殖单元的污水样品；2023年12月6日，华南地区某生猪养殖场采集6个养殖单元的污水样品；2023年12月15日，华南地区某生猪养殖场采集2个养殖单元的污水样品；2023年1月12日，华南地区某生猪养殖场采集1个养殖单元的污水样品；2023年2月9

4、日，华南地区某生猪养殖场采集3个养殖单元的污水样品，分布进行猪蓝耳病病毒检测，均检测出阳性。经污水检出阳性后对养殖单元内进行个体观察和采集唾液拭子到实验室进行核酸检测，部分猪存在发热、精神沉郁、咳嗽、食欲不振现象，存在有蓝耳病的病症，实验室也在采集的唾液拭子中检测出阳性。在感染猪蓝耳病后，猪的生殖能力受到了很大限制。公猪在感染猪蓝耳病后一般不会有明显的症状出现，有少数公猪会伴有发烧、食欲减退、精液量减少的情况发生。相对于公猪感染的反应，母猪感染后症状更明显，会突然放弃进食，并伴有嗜睡的情况出现，对于已经怀孕的母猪来说，会出现严重的流产情形。母猪在怀孕初期因为胚胎的保护作用，可对此种病毒有效的进

5、行阻隔，但在母猪的怀孕后期，由于自身抵抗力下降导致感染病毒的几率增强，引发母猪早产、流产以及胎死腹中的情形发生。由于母猪在妊娠过程中抵抗力的下降导致感染率增加，造成幼猪的死广率明显增高，很多幼猪在没有出生前便胎死腹中，即使母猪顺利的生产，也会造成幼猪身体素质差且伴有呼吸困难的症状，同时幼猪的身体较弱容易引发其他疾病从而造成幼猪的死亡。育肥猪在感染猪蓝耳病后生长速度缓慢，营养无法吸收导致体重增长迟缓，并会陆续发生死亡的现象，给养猪者带来严重的经济损失。与常规PCR检测方式相比，以10%抽样，5:1混检，试剂盒费用80元为例，10000头猪进行一次抽检的费用是1.6万元。假如每周抽检一次，即一年抽

6、检52次，全年的检测费用为83万元，平均83元/头。根据石家庄市动物疫病预防控制中心2023年8月的招标成交公告显示，采用荧光定量PCR方法检测3500头猪，中标检测费用为591150元，折合169元/头。2023年该项目中标单价为180元/头。污水监测费用是常规抽检荧光定量PCR的10%,大大减少了成本。污水检测发现阳性后，及时定位养殖单元，对养殖单元内进行个体观察和检测，可实现早发现、早防控。建立全时段的防疫体系，实现低费用、高效率的疫情预警及防控。因此，通过制定团体标准污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法，以标准为抓手，统一规范污水中猪蓝耳病病毒快速筛查的检测技术，为猪蓝耳病的预防

7、、监测提供重要依据。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法项目任务下达后，南宁壮博生物科技有限公司牵头组织成立了标准编制工作组，制定了标准编写方案，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作，具体由南宁壮博生物科技有限公司、广西扬翔股份有限公司、金陵农牧集团有限公司、巨星农牧有限公司、深圳市京基智农时代股份有限公司、济凡生物科技（常州）有限公司、广西农业职业技术大学相关人员配合。（-）收集整理文献资料标准编制工作组收集了国内有关污水中猪蓝耳病病毒快速筛查的相关技术文献资料。主要有：GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T3

8、5912-2018猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法WST799-2023污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准DB452138-2023水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光RT-PCR法专利用于检测猪蓝耳病病毒的富集浓缩试剂盒（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为原理、试剂和材料、仪器设备、样品采集及前处理、实时荧光RT-PCR检测、结果评价、检出限。（四）调研及形成草案、征求意见稿2023年7月，在前期工作的

9、基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法的要求，并结合污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法（草案）。2023年8月.10月，标准编制工作组对前期的研究和数据进了整理并结合前期技术咨询会、征求意见会的内容针对污水中猪蓝耳病病毒快速筛查进行多次讨论、研究，最终形成团体标准污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法（征求意见稿）和编制说明。四、标准制定原则（一）实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，分析污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查当前现状，

10、调研污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查的分析方法情况，在现有国家、行业标准相关污水中各种病毒测定方法要求的基础上，结合多年经验而总结起草的。符合当前使用RT-PCR法测定污水中猪蓝耳病病毒的方向与需求，有利于行业的长远发展，具有较强的实用性和可操作性。（二）协调性原则本文件编写过程中注意了与污水中猪蓝耳病病毒的测定相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。（三）规范性原则本文件严格参照GB/T1.12023标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。（四）前瞻性原则本文件在兼顾当前区内采用污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查现实检验

11、情况的同时，还考虑到了污水中猪蓝耳病病毒的测定方法快速发展的趋势和需要，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款,作为对污水中猪蓝耳病病毒快速筛查的指导。五、标准主要章节内容及确定依据团体标准污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查RT-PCR法主要内容包括原理、试剂和材料、仪器设备、样品采集及前处理、实时荧光RT-PCR检测、结果评价、检出限。（一）原理参考DB452138-2023水体中诺如病毒的核酸检测方法实时荧光RPPCR法。向污水中加入富集浓缩试剂，富集浓缩试剂可使病毒颗粒形成多聚体，通过离心作用将水溶液与病毒颗粒多聚体分开,收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，采用核酸提取和实时荧光RT-PCR检

12、测。（二）试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。用到的试剂和材料有：磷酸盐缓冲液（1mo1/1PBS,PH值7.2）、富集浓缩试剂、病毒核酸提取试剂盒、无核酸酶水：分子生物学级、离心管（15m1、50m1）、无菌移液器吸头（101.2001、1m1,带滤芯，无核酸酶）、无菌聚乙烯瓶、透明薄壁PCR管（0.2m1）o仪器设备：冰箱（020）、电子天平（精度0.01g）、高速台式冷冻离心机（可控温至-4,离心速度13000g）、低速离心机（离心速度12000rmin）、金属水浴锅、振荡混匀器、高压灭菌器、实时荧光PCR扩增仪、二级生物安全柜。（三

13、）样品采集及前处理水样采集、运送和保存：根据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处等关键位置，对未经消杀处的污水进行采样。根据现场条件和检测需求确定水样采集方式，如瞬时水样或混合水样。用无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为20Om1300m1。样本采集后，应在现场使用75%酒精对采样瓶外表面进行消毒，并及时将样本送至实验室，运输过程中水样温度保持在04实验室接到水样后应尽快进行检测，如未及时检测，应将水样置于4冰箱保存待检。对比其它行业标准中离心温度是4,本标准是-4,因为病毒会在低温下生存，不会冻死，低温下停止活动并进入休眠状态。大多数病毒耐低温，但不耐高温，在低于0的

14、温度下可以存活很长时间并保持其传染性，用-4。C离心能确保病毒的活性。病毒富集浓缩：病毒富集浓缩是本标准中较为关键的步骤，具体提操作如下： 将污水样品混合均匀，取同一厂各3管40m1的污水分别置于3个50m1离心管中，在-4、2500r/min的条件下离心30min。剩余污水样本作为备份。 将7.2.1中所得上清液分别转移至试剂盒提供的预混试剂离心管中，充分混合，震荡摇匀30min0 在-4、12OOOr/min的条件下离心12Omirb离心机降速时不应使用制动力。将离心管从离心机上取出，倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液倒出。该过程需减少沉淀的溶解与损失，以提高病毒浓缩富集效率。 在-4

15、OC、12OOOr/min的条件下离心5min,离心机降速时不应使用制动力。将离心管从离心机上取下，用移液器从每个离心管中吸出剩余的上清液。注意避免吸管尖端接触沉淀。将200U1磷酸盐缓冲液（5.1）加入至离心管中，反复吹吸沉淀，最终形成混悬液（该水样的浓缩液），同一厂3管污水悬混液合为1管浓缩液。将浓缩液转移至15m1离心管中，于O4条件下保存,并于24h内完成核酸提取和扩增。（四）实时荧光RT-PCR检测核酸提取：在二级生物安全柜中打开装有污水样本浓缩液的离心管，按照病毒核酸提取试剂盒说明，取适量浓缩液进行核酸提取，提取完成后应立即封盖并进行实时荧光RT-PCR检测。剩余的浓缩液和核酸样本应于.4条件下冻存。核酸扩增：参照猪繁殖与呼吸系统综合征（蓝耳病）荧光PCR检测试剂盒说明书（见附页）进行。每个样本设置3个平行。（五）结果评价阳性结果评价：阳性对照FAM通道与V1C通道Ct值均35且出现特异性扩增曲线。阴性对照应无Ct值，且无特异性扩增曲线，试验结果有效;否则应重新进行试验。FAM通道Ct值38且出现特异性扩增曲线，判定为病毒核酸阳性。FAM通道Ct值38Ct45,判定为可疑，应对样本进行复测,若复测结果Ct值仍在3845之间有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。阴性结果评价：通道无Ct值或无典型S型扩增曲线，同时VIC通道C