线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书.docx

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1、线粒体复合体V试剂盒说明书微法Ioo管/48样注意:正式测定前务必取23个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：线粒体复合体V又称RFO-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和Fo两个亚单位组成。该酶利用呼吸健产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体V还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体V是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。涌定原理：复合体V水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定复合体V活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板

2、、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：试剂一：10Om1X1瓶，-2Oc保存；试剂二：80m11瓶，-20保存；试剂三：2m1x1瓶，20保存；试剂四：粉剂X1支，2（TC保存；临用前加入2m1蒸储水，充分溶解备用，用不完的试剂仍2（C保存；试剂五：8m11瓶，4保存；试剂六：粉剂X1瓶，4匕保存：临用前加入4m1蒸储水，充分混匀；溶解后4C保存一周：试剂七：粉剂X1瓶,49保存；临用前加入IOm1蒸馅水，充分混匀；溶解后4*C保存一周：试剂八：粉剂X1瓶,4保存；临用前加入IOm1蒸储水，充分混匀；溶解后42保存一周；试剂九：液体IOm1x1瓶，室温保存。定磷试剂的配制：按HzO:试剂七:试

3、剂八:试剂九=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。注意，配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入Im1试剂一和IOU1试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆600g,4*C离心5min弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4C离心IOmin。上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体V（此步可选做步骤中的沉淀即为线粒体，加入800u1试剂二和8u1

4、试剂三,超声波破碎（冰浴,功率20%或200W,超声3$,间隔10秒，重复30次），用于复合体V酶活性测定。渊定步IIh1、前促反应(在EP管中加入下列试剂)震合体V活性计算：a.使用微石英比色皿测定的计算公式如下：标准条件下测定的回归方程为y=1274x+0.004;X为标准品浓度(mmo11),y为A值。I、组织中复合体V活性的计算：(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生InmoI无机磷定义为一个酶活性单位。复合体V活性(nmo1/min/mgprot)=(A-0.004)1.274V反总x1O6(V样XCPr)T=62.8(A-0.004)Cpr此法需要自行测定样本

5、蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟产生InmoI无机磷定义为一个酶活性单位。复合体V活性(nmo1/min/g鲜垂)=(A-0.004)1.274V反总x1O6(WxV样V样总)T=50.7(A-0.004)W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmo1无机磷定义为一个酶活性单位。复合体V活性(nmo1/min104ce11)=(A-0.004)1.274V反总x106(500xV样V样总)T=0.101(A-0.004)V反总：反应体系总体积，1.21O41;V样：加入样本体积，0.05m1；V样总：加入提取液体积，0.808m1；T：

6、反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。b使用96孔板测定的计算公式如下：标准条件卜.测定的回归方程为y=0.637x+0004;X为标准品浓度(mmo11),y为A值。(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生InmOI无机磷定义为一个酶活性单位。复合体V活性(nmo1/minmgprot)=(A-0.004)M).637xV反总x16H(V样XCPr)T=125.6(A-0.004)Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟产生InmO1无机磷定义为一个酶活性单

7、位。竟合体V活性(nmo1/min/g鲜重)=(AA-0.004)0.637xV反总x1O6(WxV样V样总)T=101.5(A-0.004)W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmo1无机磷定义为一个防活性单位。复合体V活性(nmo1/min104ce11)=(A-0.004)0.637V反总x106(500xV样V样总)T=0.203(A-0.004)V反总：反应体系总体积，1.21(T41;V样：加入样本体积，0.05m1；V样总：加入提取液体积，0.808m1；T：反应时间，30min：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。