玉米谷蛋白水解物对乙醇诱导损伤LO2细胞的保护作用.docx

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1、96孔板继续培养24h,24h后测细胞存活率，测定方法同1. 8o1. 11CGH对L02细胞内R0S的清除能力测定参照文献11的方法测定细胞内R0S的清除能力。1.12数据处理实验中的数据均以平均值土标准偏差表示。用SPSSStatisticsl9.0进行统计学分析,数据间的显著性差异采用单因素方差分析最小显著差别(leastsignificantdifference, LSD)检验,P0. 05 为差异性显著水平。用GraphPadPrism5绘制图表。2结果与分析2. 1CGH体外抗氧化活性分析如表1所示,CGH能够有效清除 OH.DPPH自由基和提高Fe2+螯合能力，且在一定范围浓度内

2、，抗氧化活性随着CGH浓度自由基清除能力和Fe2+螯合能力。酶法改性使得一些配位能力较强的基团例如跋基裸露出来，易于与Fe2+发生络合反应,使其具有更好的金属离子鳌合能力14。CGH良好的金属螯合能力可以通过螯合Fe2+来阻止Fe2+与H202反应产生 0H。同时，CGH中一些疏水性基团的暴露，增强了其与DPPH自由基反应能力，从而提升了对DPPH自由基的清除能力。这与王晓杰等14的研究一致。以上结果表明CGH既是良好的供氢体，也是Fe2+螯合剂，能通过抑制Fenton反应而减少羟基的生成，提高自由基的清除能力，从而消除自由基对机体造成的氧化性损伤。2. 2CGH对L02细胞存活率的影响如图1

3、所示，不同浓度的CGH对L02细胞存活率存在显著性差异(P0.05),与对照组相比，CGH质量浓度为12.5-2000 g/mL时，细胞存活率均大于对照组细胞存活率，即可自由基清除能力和Fe2+螯合能力。酶法改性使得一些配位能力较强的基团例如跋基裸露出来，易于与Fe2+发生络合反应,使其具有更好的金属离子鳌合能力14。CGH良好的金属螯合能力可以通过螯合Fe2+来阻止Fe2+与H202反应产生 0H。同时，CGH中一些疏水性基团的暴露，增强了其与DPPH自由基反应能力，从而提升了对DPPH自由基的清除能力。这与王晓杰等14的研究一致。以上结果表明CGH既是良好的供氢体，也是Fe2+螯合剂，能通

4、过抑制Fenton反应而减少羟基的生成，提高自由基的清除能力，从而消除自由基对机体造成的氧化性损伤。2. 2CGH对L02细胞存活率的影响如图1所示，不同浓度的CGH对L02细胞存活率存在显著性差异(P0.05),与对照组相比，CGH质量浓度为12.5-2000 g/mL时，细胞存活率均大于对照组细胞存活率，即可自由基清除能力和Fe2+螯合能力。酶法改性使得一些配位能力较强的基团例如跋基裸露出来，易于与Fe2+发生络合反应,使其具有更好的金属离子鳌合能力14。CGH良好的金属螯合能力可以通过螯合Fe2+来阻止Fe2+与H202反应产生 0H。同时，CGH中一些疏水性基团的暴露，增强了其与DPP

5、H自由基反应能力，从而提升了对DPPH自由基的清除能力。这与王晓杰等14的研究一致。以上结果表明CGH既是良好的供氢体，也是Fe2+螯合剂，能通过抑制Fenton反应而减少羟基的生成，提高自由基的清除能力，从而消除自由基对机体造成的氧化性损伤。2. 2CGH对L02细胞存活率的影响如图1所示，不同浓度的CGH对L02细胞存活率存在显著性差异(P0.05),与对照组相比，CGH质量浓度为12.5-2000 g/mL时，细胞存活率均大于对照组细胞存活率，即可在此浓度范围内进行后续试验研究。后的细胞存活率的趋势与本实验结果一致。2. 5CGH对乙醇损伤后L02细胞内ROS含量的调节作用ROS是细胞内

6、氧分子结合电子后的产物，包括超氧阴离子、H202和-0H等，在细胞中能与生物大分子结合，破坏其生理活性，进而对细胞造成损伤。图4为不同浓度CGH作用L02细胞后，细胞内ROS相对水平。图4CGH对乙醇损伤后的L02细胞内ROS含量的影响Fig. 4EffectofCGHonR0ScontentinL02cellsafterethanolinjury从图4中可以看出，与对照组相比，经4%乙醇诱导损伤后的L02细胞中ROS含量显著提高(P0. 05),表明乙醇诱导氧化应激导致L02细胞内ROS含量大量积累。与损伤组相比，经不同浓度CGH预处理后L02细胞内ROS含量显著下降(P0. 05)。CGH

7、在25 u g/mL时对处理组细胞内ROS清除能力较损伤组提高约3倍。图5中的系列照片表示的是CGH在不同浓度下预处理L02细胞后，用荧光倒置显微镜拍摄的细胞荧光照片。其中图5-a为对照组，图5-b为4%乙醇诱导损伤组，图5-c图5-e依次为蛋白质量浓度为25、50、100gmLCGH预处理组。a-对照；b-损伤；c-25 g/mL 蛋白；d-50 g/mL 蛋白；e-100 g/mL 蛋白图5L02荧光图片Fig.5L02cellfluoresencephotograph从图5中可以看出，L02细胞经乙醇诱导损伤后，细胞内ROS含量较高，荧光强度强。可能是乙醇进入L02细胞内，使细胞内ROS

8、含量增加进而导致细胞氧化损伤，当DCFH进入细胞后，被细胞内ROS氧化成DCF,使细胞内荧光强度增强，ROS值变大。经不同浓度的CGH处理细胞，细胞内的荧光强度均有所减弱。综合图4和图5可以看出，当CGH质量浓度为25gmL时，ROS含量最低，荧光强度最弱。可能是低浓度的CGH可以正向调节Nrf2通路，进而减少ROS的产生，而高浓度的CGH会激活Nrf2通路的逆反应，削弱CGH对ROS的清除能力。我们推测是CGH中含有一定量的谷氨酰胺，谷氨酰胺能够通过调节Nrf2通路减轻因乙醇引起的细胞氧化损伤，减少ROS的产生，进而保护细胞免受氧化应激损伤16 oWANG等17以玉米蛋白为原料，研究玉米蛋白

9、对氧化损伤的肝癌细胞的ROS清除能力的影响，发现玉米蛋白具有很好的ROS清除能力。2. 6CGH对L02细胞内SOD的影响超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)在人体氧化和抗氧化的平衡中起作用，可以通过清除过量的超氧阴离子自由基来保护细胞18。图6为不同浓度CGH作用乙醇诱导损伤的L02细胞后，细胞内SOD活力。Fig.5L02cellfluoresencephotograph从图5中可以看出，L02细胞经乙醇诱导损伤后，细胞内ROS含量较高，荧光强度强。可能是乙醇进入L02细胞内，使细胞内ROS含量增加进而导致细胞氧化损伤，当DCFH进入细胞后，被细胞内ROS氧化

10、成DCF,使细胞内荧光强度增强，ROS值变大。经不同浓度的CGH处理细胞，细胞内的荧光强度均有所减弱。综合图4和图5可以看出，当CGH质量浓度为25gmL时，ROS含量最低，荧光强度最弱。可能是低浓度的CGH可以正向调节Nrf2通路，进而减少ROS的产生，而高浓度的CGH会激活Nrf2通路的逆反应，削弱CGH对ROS的清除能力。我们推测是CGH中含有一定量的谷氨酰胺，谷氨酰胺能够通过调节Nrf2通路减轻因乙醇引起的细胞氧化损伤，减少ROS的产生，进而保护细胞免受氧化应激损伤16 oWANG等17以玉米蛋白为原料，研究玉米蛋白对氧化损伤的肝癌细胞的ROS清除能力的影响，发现玉米蛋白具有很好的RO

11、S清除能力。2. 6CGH对L02细胞内SOD的影响超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)在人体氧化和抗氧化的平衡中起作用，可以通过清除过量的超氧阴离子自由基来保护细胞18。图6为不同浓度CGH作用乙醇诱导损伤的L02细胞后，细胞内SOD活力。图6CGH对乙醇诱导损伤的L02细胞内SOD活力的L02细胞GR活力和GSH水平较损伤组显著升高(P0. 05) o表明CGH能够提高乙醇诱导损伤细胞内的GR活力和GSH水平，减轻乙醇对L02细胞的氧化损伤，可能是CGH调控了谷胱甘肽系统，提升了 GR的活性，清除细胞内过量自由基，进而起到保护细胞的作用。WANG等19研究了玉米蛋白抗氧化肽对HepG2细胞内抗氧化酶活力和总GSH水平的调控作用，结果表明玉米肽可以提高过氧化氢诱导损伤细胞的抗氧化酶活力。3结论CGH具有良好的体外抗氧化活性，CGH的0H清除率、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合率的IC50值分别为0. 61、3. 96、0. 79mgmLo细胞试验表明CGH对细胞无毒性作用，且能显著改善乙醇诱导L02细胞氧化应激损伤。CGH能够降低细胞内的ROS水平，还能提高SOD和GR的活力及GSH水平，对乙醇诱导L02细胞氧化损伤具有较为明显的保护作用。本研究为玉米源抗氧化功能食品及食品基料奠定理论基础。