高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程.docx

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1、ICS65.020CCSB15B53云南省地方标准DB53/TXXXX2022高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程2022-XX-XX实施2022-XX-XX发布云南省市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会(YNTC07)归口。本文件起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。本文件主要起草人：李婕、黄应昆、单红丽、王晓燕、张荣跃、仓晓燕、王长秘、尹炯、罗志明。高粱花叶病毒RT-

2、PCR检测技术规程1范围本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、试剂、检测样品的取样及对照设置、检测方法和结果判定等。本文件适用于高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)侵染的植物样品的RT-PCR检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1高粱花叶病毒Sorghummosaicvirus高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属Potyvirus),是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，英文名称为Sorghummosaicv

3、irus,缩写为SrMV,参见附录A。3.2RT-PCR反转录聚合醐链式反应(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)的简称，是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得RNA特定片段。4仪器与耗材4.1 仪器主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液器、研钵等。4.2 耗材无核酸酶(Nuclease-free)的1.5mL和2.0mL离心管及0.2mLPCR管等。5试剂5.1 常

4、规试剂液氮、焦碳酸二乙酯(DEPC)灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70%乙醇、异丙醇、无水乙醇等。DB53/TXXXX20225. 2RT-PCR试剂Oligo(dT)l8引物(0.5ng/|iL),RT-PCR反转录试剂盒，含澳酚蓝染料的2xEasyTqPCRSuperMix聚合酶混合物。5.3引物5.3.1上游引物SrMV-F：5-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3,下游引物SrMV-R：5Z-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3Z(R=A/G,Y=C/T)o5.3.2用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为201dM的水溶液。

5、5. 3.3目的扩增片段约为820bpo5.4 电泳缓冲液的配制按以下步躲配制电泳缓冲液：a)称取242g的Tris,先用300mL的ddH2O搅拌溶解后,加10()mL().5mol/L的EDTA水溶液配制50XTAE储存液；b)用ddH2O将储存液稀释50倍配制IxTAE工作液；c)称取Tris108g、硼酸55g、7.44g的Na2EDTA-2H2O,加入40mL0.5mol/L的EDTA水溶液，再用ddH2O定容至1000mL配制lOxTBE储存液；d)用ddH2O将储存液稀释20倍配制0.5XTBE工作液。5.5 扩增产物电泳检测试剂1%左右(W/V)琼脂糖，核酸染料。6检测样品的取

6、样及对照设置6.1 阳性对照以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。6.2 阴性对照以健康植物样品作为阴性对照。6.3 空白对照以灭菌ddFhO作为空白对照。6.4 取样戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品，且每采一个样品跟换一次手套，过程中不应交叉污染。将采的集样品放入自封袋中，编号，冷藏运输到实验室液氮速冻后，于-80。冰箱保存备用。7检测方法7.1总RNA提取总RNA提取步骤如下：a)戴一次性手套称取0.1g待测样品置于灭菌研钵中，液氮冷冻，研磨至粉状后放入1.5mL离心管中，并对每支管进行编号；b)用核酸提取试剂盒提取样品总RNA,按提取试剂使用说明书进行操作；c)提取后用蛋白/核酸

7、分析仪测定RNA相对浓度，当A260/A280比值为1.82.0时，可用于RT-PCR检测。7.2反转录按以下步骤进行反转录：a)以提取的总RNA为模板，在PCR管中按序依次加入：Oligo(dT)i8引物约0.5|jL、RNA模板约2.0pL(约200ng)、反转录试剂、灭菌DEPC水补足10吐反转录反应体系，混匀；b)2000rpm快速离心1()s,放入PCR仪合成cDNA,按RT-PCR试剂盒说明书进行操作。7.3PCR扩增按以下步骤进行PCR扩增：a)以合成的cDNA第一链为模板，在PCR管中按序依次加入：灭菌DEPC水7.2pL、含滤酚蓝染料的2xEasy7hqPCRSuperMix

8、聚合酶混合物10.L、反转录产物(cDNA)2.0-L、0.4jiL上游引物SrMV-F(20-M)、0.4gL下游引物SrMV-R(20.M),制成20匹PCR反应体系，2000rpm快速离心10s混匀后放进PCR仪进行PCR扩增；b) 94预变性5min；c) 94变性30s,60退火30s,72c延伸1min,35个循环；d) 72c延伸10min。e) 4琼脂糖凝胶电泳检测按以下步骤进行：a)用IxTAE或0.5XTBE缓冲液配制1.0%左右(W/V)琼脂糖胶，加热至琼脂糖完全熔化；b)待凝胶冷却至5()C60时，在l()()mL琼脂糖胶中加入适量的核酸染料，混匀；c)将凝胶倒入置有样

9、品梳的制胶板上；d)待凝胶充分冷却后，拔除样品梳，将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入装有IxTAE或0.5XTBE电泳缓冲液的水平电泳槽；e)每个样品取10PLPCR扩增产物加入样品梳孔，在其中一个样品梳孔中加入6gLDNA分子量标准(MarkerE),130V恒定电压下电泳25min；f)电泳结束后，把胶板取出用凝胶成像仪观察、拍照。8结果判定阳性对照在820bp左右有条带，阴性对照和空白对照无条带，则检测结果有效。RT-PCR检测结果判定详见表1。表1RT-PCR检测结果判定判定条件结果判定RT-PCR产物在82()bp左右有无条带出现(参见附录B)序号空白对照阴性对照阳性对照检测样品1无

10、无有有检测结果有效，被检测甘蔗样品感染高粱花叶病毒2无无有无检测结果有效，被检测甘蔗样品未感染高粱花叶病毒3有/无有/无无有/无检测结果无效，将实验中的所有试剂更换，并重新提取检测样品RNA,进行RT-PCR检测附录A(资料性)高粱花叶病毒A.1局粱花叶病毒高粱花叶病毒(Sorghummosaic所)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，英文名称为Sorghummosaicvirus,缩写为SrMV。A.2病原特征A.2.1病毒粒体SrMV病毒粒体呈弯曲线状，无包膜，螺旋对称结构，大小为(750850)nmx(1315)nm。A.2.2基因组基因

11、组由一条正单链RNA组成，大小约1()kb,编码一个多聚蛋白，经蛋白酶水解后可产生1()个成熟的蛋白质，从N端到C端依次是Pl、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、Nib和CP,还在P3氨基端编码区发生移码翻译出P3N-PIPO。A.3寄主在自然条件下，SrMV可侵染甘蔗(Succham，nofficinarum)、高粱QSorghumbicolor)、玉米(Zeamays)和细叶芒(Miscanthussinensis)等禾本科植物。A.4病害症状SrMV侵染为害叶片，花叶症状主要表现在叶片上，尤以新叶基部症状最为明显；病毒可系统侵染，导致整丛蔗株发病，

12、叶色褪绿，产生许多与叶脉平行的黄绿相间不规则条纹，大小长短不一，布满叶片，与正常部分参差间隔成“花叶”；病株生长差、矮化、分衰少，汁液量减少。A.5传播途径SrMV可通过带毒的无性繁殖材料(种质)、田间病株及种传等方式传播，可通过收获机械、刀具和摩擦接种等方式传播，也可被多种蛇虫(甘蔗棉场CeSouac及山黑豆蛛cwcchs。、桃蜥persicae和玉米蛾Rhopakipln4mmaidis)以非持久方式传播。A.6分布主要分布于印度、美国、巴西、阿根廷、日本、菲律宾、澳大利亚、中国等国家。附录B（资料性）高粱花叶病毒RT-PCR检测电泳图高粱花叶病毒RT-PCR检测电泳图见图B.1oMl2345678910PCNCCKM：MarkerE；1-5：感染高粱花叶病毒的甘蔗样品；6-10：未感染高粱花叶病毒的健康甘蔗样品;PC：SrMV阳性对照；NC：阴性对照；CK：空白对照。图B.1高粱花叶病毒RT-PCR检测电泳图