双向电泳操作步骤蛋白质技术.docx

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1、双向电泳操作步骤-蛋白质技术水化上样(被动上样)1 .从冰箱中取出IPG胶条，室温放置IOmino2 .沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各Icm左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。3 .用银子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱,应小心操作。4 .将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镜子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。5 .放置3045min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油

2、,每根胶条约3m1(17cmIPG),防止胶条水化过程中液体蒸发。6 .置等电聚焦仪于-20。C水化1115h。第一向等电聚焦1 .将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH20581润湿。2 .取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。3 .将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。4 .在每根胶条上覆盖2-3m1矿物油。5 .对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。6 .聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，-20。水箱保存，电泳前

3、取出胶条，室温放置10分钟,使其溶解。第二向SDS-PAGE电泳1 .配制12%的丙烯酰胺凝胶。2 .待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MiI1iQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MiIIiQ水冲洗。3 .配制胶条平衡缓冲液I4 .在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用Mi1IiQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。5 .将胶条转移至样品水化盘中，加入6m1Q7cmIPG）平衡缓冲液I,在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。6 .配制胶条平衡缓冲液II07 .第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸

4、上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。8 .用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。9 .将琼脂糖封胶液加热溶解。10 .在IOOm1量筒中加入TGS电泳缓冲液。11 .第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。12 .用银子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在IX电泳缓冲液中漂洗数次。13 .将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。14 .用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。15 .放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。16 .打开二向电泳制冷仪，调温度为15。&17 .将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流(5mA-10mAge117cm),待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(20-30mAge117cm)待漠酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。18 .电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套”方止污染胶面)。19 .进行染色。