基于蛋白质组学的菲律宾蛤仔凝集素MCLT抑制腐败希瓦氏菌机理研究.docx

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1、摘要:为探究菲律宾蛤仔尉d初esPhi1ippinarum凝集素(MC1-T)诱导产生及其抑制腐败希瓦氏菌Shewane11aWrece7s的作用机制，以腐败希瓦氏菌刺激菲律宾蛤仔，并利用固相吸附分析MC1-T与腐败希瓦氏菌外膜蛋白(OUtermembranePrOteins,OMP)的相互作用,利用非标记(1abeI-free)定量蛋白质组方法对MC1-T作用于腐败希瓦氏菌的蛋白质组进行分析。结果表明：注射比浸泡方式产生更多的MC1-T；MC1-T与腐败希瓦氏菌外膜蛋白结合具有浓度依赖性；MC1-T作用于腐败希瓦氏菌后，有74个蛋白质表达量变化显著，其中，16个蛋白质表达量上调，58个蛋白质

2、表达量下调，这些差异表达蛋白质主要参与氨基酸生物合成途径、丙酮酸代谢途径、柠檬酸循环途径、氨酰TRNA生物合成途径和碳代谢途径。研究表明，MC1-T是通过影响腐败希瓦氏菌体内氨基酸合成、丙酮酸代谢和柠檬酸循环等实现其抑菌作用。关键词：菲律宾蛤仔；凝集素；腐败希瓦氏菌；固相吸附；蛋白质组学腐败希瓦氏菌Shewane11aputrefaciens是鱼虾贝等新鲜水产品的典型腐败菌(SPeCifiCSPOiIageOrganiSnI)O在水产品冷藏期间,该菌在还原氧化三甲胺的同时产生KS,进而使得这些冷藏水产品呈现出酸臭腐败味。由于腐败希瓦氏菌在水产品表面产生被膜,且较难清除，给水产品加工与贮藏带来严

3、重危害。利用天然生物活性物质可以抑制富含蛋白质的水产品保鲜贮藏过程中的腐败希瓦氏菌。因此，预防保鲜过程中腐败问题的关键是抑制腐败希瓦氏菌。凝集素是一种非酶、非免疫球蛋白的多价糖结合蛋白或蛋白质。水生生物来源的凝集素具有抑菌活性，这对食品保鲜尤为重要，已经成为近年来的研究热点。1iU等、Huang等和Zhang等研究发现，许多水生生物来源的凝集素具有较好的抑菌活性。但生物体内凝集素含量较低,且对其抑菌机制尚不明确，这阻碍了水生生物凝集素的实际应用。天然生物保鲜剂，尤其是水生生物来源的凝集素，是一种来源安全、潜在的可应用于水产品加工与贮藏中的天然生物抑菌剂。目前，已经发现的菲律宾蛤仔Ruditap

4、esphHippinarum多种凝集素为其天然免疫因子，对多种微生物具有天然抵抗防御作用。尽管有不少学者对菲律宾蛤仔凝集素与微生物相互作用进行了较多研究，但未见其抑制腐败希瓦氏菌机制的报道。本研究中，利用固相吸附分析了菲律宾蛤仔凝集素(MC1-T)与腐败希瓦氏菌外膜蛋白(OUtermembraneproteins,OMP)的相互作用，利用非标记定量蛋白质组方法分析了MC1-T作用前后腐败希瓦氏菌蛋白表达的变化，以期从分子水平上获得MC1-T抑菌机制，为MC1-T在水产品加工与贮藏中的应用提供基础数据。1材料与方法1.1 材料腐败希瓦氏菌模式菌株CICC22940由中国工业微生物菌种保藏管理中心

5、提供。试剂:无菌绵羊血(20%)(上海伊卡生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶(H即)、牛血清蛋白(BSA)(北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白月东大豆肉汤（TSB）（青岛海博生物技术有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素、二硫苏糖醇（DTT）、口引噪乙酸（IAA）（美国Bio-Rad公司）；BCA定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；胰蛋白酶（TrPSin）（美国Promega公司）；相对分子质量为10000的超滤离心管（德国Sartorius公司）；其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。仪器与设备：ZDP-A2160A型曲线控制恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）;Mu1tis

6、kanMK3型酶标仪（美国Thermo公司）；5430R低温高速离心机、真空离心浓缩仪（德国Eppendordf公司）；Trip1eTOF6600+质谱仪（美国ABSCIEX公司）；Agi1ent1290Infinity1C超高压液相色谱仪（美国Agi1ent公司）。1.2 方法1.2.1 腐败希瓦氏菌体的制备取腐败希瓦氏菌株，按照中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的菌种说明书进行培养，培养后的菌悬液用生理盐水洗涤3次，每次均在4C下以4000r/min离心10min,收集菌体备用。1.2.2 腐败希瓦氏菌刺激菲律宾蛤仔试验将菌体用生理盐水悬溶,调节其OD噜分别为0.5、1.0、15、2.0、

7、2.5,制成不同浓度的菌悬液，分别标记为s-0.5、s-1.0、S-15.S-2.0、s-2.5。将暂养1d的菲律宾蛤仔（体质量8g1g）分为7组，每组25只，分别放入盛有300m1、（223）C海水的洁净搪瓷托盘（20cm25cm4.5Cn1）内。第1组不做任何处理作为空白组，第26组分别用1m1无菌注射器向每只菲律宾蛤仔足肌中注射IOO1S-0.5、S-1.0、S-15、s-2.0、s-2.5的菌悬液，第7组海水中加入2.5m1S-1O菌悬液并记为浸泡组，每组试验设3个平行。在海水中培养12、24、36h时，分别收集每组的海水，4下以9000r/min离心15min,上清液用80%饱和度的

8、硫酸筱盐析12h,相同条件下再离心，取沉淀用去离子水溶解并透析、冻干，得到MC1-T冻干粉。试验过程中观察每组菲律宾蛤仔的死亡情况，试验结束时测定每组MC1-T冻干粉的质量。按佟长青等的方法检测各组MC1-T冻干粉对无菌绵羊血细胞的凝集活性。12.3MC1-T对腐败希瓦氏菌的抑制作用取腐败希瓦氏菌株，按照菌种说明书进行培养，培养12h后用无菌TSB培养液稀释1000倍，混匀后分装12个锥形瓶中，分别加入不同量的MC1-T冻干粉，使其终浓度分别为0、0.01、0.1、1omgm1,相同培养条件下继续培养24h,测定630nm波长下各组的吸光度，检测MC1-T对腐败希瓦氏菌生长抑制情况。1.2.4

9、 MC1-T-HRP固相吸附试验腐败希瓦氏菌外膜蛋白(OUtermembraneproteins,OMP)的制备与包被酶标板，以及MC1-T-HRP酶联物的制备参考文献22-25中的方法。分别取稀释100、200、400、800、1600倍的MC1-T-HRP酶联物稀释液(对应终浓度分别为55.56、27.78、13.89、6.94、3.47gm1)各100U1,加入包被后酶标板中，4C过夜。用PBS洗液洗涤3次后，再加入IOOH1新配制的0.4mg加1邻苯二胺(用PH50的磷酸-柠檬酸配制)和15H1Hoj容液，于37下孵育10min后，立即加入2mo1/1HSO1终止反应，测定492nm下

10、的吸光度。空白以BSA代替腐败希瓦氏菌OMP。试验设置3个平行，测定MC1-T与腐败希瓦氏菌OMP的结合情况。1.2.5 PH对MC1-T-HRP结合腐败希瓦氏菌OMP的影响将包被后酶标板各孔内分别加入90R1O.05mo1/1的HAC-NaAC(PH5.0)、NaHPO,一NaHPo,(pH6.0)、NaHPo1NaHP0：(pH7.0)、Tris-HCKpH8.0)、G1y-NaOH溶液(pH9.0),然后再加入901MC1-T-HRP,4下过夜。用PBS洗液洗涤3次，余下操作同固相吸附测试，考察不同PH条件下，MC1-T与腐败希瓦氏菌OMP的结合情况。1.2.6 蛋白质组学分析样品的制备

11、将“1.2.3节”中测定吸光度后的0mg/m1MC1-T组标记为C组，1Omg/m1MC1-T组标记为1组，离心，收集菌体，用生理盐水洗涤3次后，以SDT裂解液(40g/1SDS,100mmo1/1Tris/HC1,1mmo1/1DTT,pH7.6)在沸水浴下裂解10min,超声破碎细胞后离心，收集上清液，即为蛋白质组样品。1.2.7 SDS-PAGE电泳将蛋白质组样品与上样缓冲液混合后进行沸水浴5min,将离心10min(14000向后的上清液进行SDS-PAGE。1.2.8 样品酶解及酶解产物的1C-MS/MS鉴定根据翟兴月等的方法对1组和C组蛋白质组样品进行胰蛋白酶酶解，获得酶解液。取2

12、g酶解产物(OD”定量)进行1C-MS/MS分析。1. 3数据处理将1C-MS/MS原始文件导入Maxquant软件13.0.5中进行查库和1FQ非标记定量分析，数据库为(uniprot_shewa11a_126111_20161009.fasta)o试验数据以平均值土标准差(meanS.D.)表示，采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，用DUnCan法进行组间多重比较。2结果与分析1.1 腐败希瓦氏菌对菲律宾蛤仔产生凝集素的影响将不同浓度的腐败希瓦氏菌注射入菲律宾蛤仔体内后，各组在海水中培养12、24、36h后，蛤仔的死亡情况及养殖海水中收集的MC1-T冻干粉量如表1所示，随着养殖时间

13、的延长，各组菲律宾蛤仔死亡率均明显上升，且在第36h时死亡率为87%100%,同时，从各组海水中收集的MC1-T冻干粉量也明显增加，表明菲律宾蛤仔在养殖过程中特别是死亡过程中分泌到体外的物质量增加。表1菲律宾蛤仔死亡率及养殖海水中MC1-T冻干粉量Tab.1Morta1ityofMani1ac1amRuditapesphi1ippinarumandamountofMC1-T1yophi1izedpowderinthecu1tureseawater组别group死亡率morta)i1y%MC1-T冻干粉MC1-TIyOP1IiIfacedPOWdet/mg12h24h36h)2h24h36h空1

14、2.223857.777.7487.8021.1334.6320.6294.3073.03535.97428.05S-0.54.437.6821.25.7389.779.0166.0376.04113.5099.17496.57415.46S-1.00.0.20.24.0687.8011.6948.3012.873.87247.55584.45340.99S-1.50.000.0025.57土18.9792.336.8177.9349.51167.33102.95635.70395.12S-2.02.223.8547.9045.671(M).().(X)105.2092.60226.20286

15、.01598.30573.18S-2.54.437.6846.5735.I198.7742.14211.97202.79446.93188.86681.45559.03对各组提取的MC1-T冻干粉进行凝集活性检测，结果显示，随着菲律宾蛤仔死亡率的增加，MC1-T凝集活性也略有增强，且ST.O组凝集活性大于其他各组。2. 2MC1-T的抑菌作用从表2可见，低浓度(0.01mgm1)MC1-T对腐败希瓦氏菌的生长具有一定程度的抑制作用，但不显著(Q0.05),当MC1-T在培养液中浓度达到0.1mg/m1以上时，其抑制作用显著增强(/K0.05)。在试验过程中还发现，含有高浓度MC1-T的培养液中，菌体量较少，且有部分团状物出现，但经剧烈振荡后，可以使团块分散。表2MC1-T对腐败希瓦氏菌的抑制作用Tab.2InhibitoryeffectofMC1-TagainstShewane11aputrefaciensMC1-T质地浓度COnCentratiOnOfMC1-T/(mgm1.)00.010.11.0ODMoi0.1410.(X)640.135O.(MM0.1210.81,0.093().(M)8注：同行中标有不同字母者表示组间有显著性差异(W