发光免疫分析.docx

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1、发光免疫分析发光免疫测定采用化学发光物质作为标记物，根据发光原理的不同，可分为三类：化学发光免疫分析(chemi1uminescenceimmunoassay,C1IA);酶增强发光免疫分析(enhancedchemiIuminescenceenzyineimmunoassay,EC1EA)；电化学发光免疫分析(e1SPECTrochemiIuniinescenceinimunoassay,EC1IA)o一、化学发光免疫分析(chemi1uminescenceimmunoassay,C1IA)(一)原理：发光物质标记抗体或抗原，标记的发光物质通过氧化反应获得能量，处于激发态，当返回基态时以光子

2、的形式释放能量，其发光强度与被测物质浓度相关。用于标记物的化学发光物质有：氨基苯二酰明类即异鲁米诺及其衍生物，如氨基己基乙基异鲁米诺(AHEI)、氨基丁基乙基异鲁米诺(ABEI)、半琥珀酰胺、硫代异氤酸等；叫嗟酯类；苯酚类化合物；咪嘎类；芳基草酸脂类。目前应用较为广泛的是口Y唉酯类。口Y嘘酯(acridiniumester)是一种三环有机化合物，在碱性介质中易氧化，其氧化过程经历多价键的断裂，经过一个二氧酮的中间体，产生一个电激发的10-甲基t1Y唉酮，当它回复到基态时在43Onm处释放出光子。叫嗟酯的特点是：分子量小，因而对被标记物的空间位阻小；发光反应快速而强烈，背景噪音低；直接发光，无需

3、酶催化，反应时间短，误差小；受PH和温度影响小，检测精确度高；性质稳定，试剂保存期长。现以Bayer公司的ACS-180检测系统为例加以说明。(二)试剂盒组成1校正试剂：参见时间分辨荧光免疫分析。2 .叫咤酯标记的抗原或抗体由于在碱性条件下水溶液中存在有内源性过氧化物，可使发光化合物缓慢地失去活性，故标记物应保存于pH7.0以下。3 .抗体包被的顺磁性固相微粒是以三氧化二铁为核心的聚苯乙烯颗粒，直径12m,特点是表面积大，可吸附大量抗体；均匀地悬浮在反应体系中，类似均相反应，可有效提高反应效率。4 .试剂1：0.5%H202,0.INHNOao5 .试剂2：0.25NNa0Ho(三)检测步狭全

4、部试验过程均在全自动化学发光免疫检测系统上按预设程序自动完成，整个检测过程用时20min左右。步躲如下：1待测标本或校正试剂+口丫咤酯标记的抗原或抗体+顺磁性固相抗体；2 .37温育一定时间；3 .磁场作用于磁性微粒使之沉淀；4 .吸去上清液，除去未与固相抗体结合的游离抗原和（或）抗体；5 .洗涤磁性微粒2次；6 .加入试剂1；7 .加入试剂2,使叫喘酯氧化处于激发态后回复基态，并发出光子，整个过程在Is内完成；8 .ACS：180的光度检测系统读取发光强度并经数据处理计算待测物质浓度。（四）资料保存及报告要求参见时间分辨荧光免疫分析。（五）质量控制见放射免疫部分（六）注意事项1 .应严格按照

5、仪器说明书要求做好维护保养工作，保持管路清洁畅通。2 .性固相微粒保存于缓冲液中，易沉淀，应在加样过程中持续旋转混匀，避免加样不均。混匀时注意不可产生泡沫。3 .为使本底降到理想水平，除采用纯化学试剂外，应使用Q21000kQ的去离子水。二、酶增强发光免疫分析（enhancedchemiIuminescenceenzymeinimunoassay,EC1EA）（一）原理EC1EA是将化学发光物质作为酶的发光底物，由酶触发化学发光物质激发过程，产生光子。通过酶标抗原或抗体间的竞争性或非竞争性免疫结合反应，形成酶标复合物，再加化学发光底物，经酶促反应发光。其发光持续时间可长达30TIi1I以上，同

6、时发光强度也大为提高，改善了信噪比，提高了灵敏度。目前常用的EC1EA系统有两种：1 .辣根过氧化物酶-压。2-鲁米诺-增强剂系统在此系统中辣根过氧化物酶（HRP）可使山。2产生新生作用于鲁米诺，形成激发态中间体，并分解发光，经增强剂（如对位碘酚、对位苯基酚）作用，可使发光时间延续30InirI以上，信号强度增加IOOO倍以上。该系统已开发成熟的商业性试剂如AnIer1ite系统。2 .碱性磷酸酶-环1,2-二氧乙烷衍生物系统常用的发光底物为金刚烷基1,2-二氧乙烷磷酸盐以及3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1,2-环二氧乙烷，简称AMPPD。AMPPD经酶解去除

7、芳香基团上的一个磷酸基，得到中等“稳定”的中间体AMPPD一（半衰期230min）,并进一步裂解为金刚烷酮和激发态的间氧苯甲酯阴离子，当其跃迁回到基态时产生光子（波长470nm）.AMPPD在碱性和热环境下稳定性好，故本底低，PH7.0时，室温下分解半衰期长，pH9.5时酶解速度快，发光持续1560min,光强度稳定，在0.居BSA的反应液中发光强度明显增强。现以DPC公司的仪器为例加以说明。（二）试剂盒组成1 .校正试剂参见时间分辨荧光免疫分析。2 .碱性磷酸酶（AP）标记抗体或抗原要求标记物稳定不失活。4。C可保存数月。3 .Testunit为盛有抗体包被小珠的测试杯，兼作离心管用，在IO

8、OoO转/秒的离心作用下清洗包被珠并将洗涤液排出到测试杯的外圈夹层中，为公司的专利。4.发光底物。（三）检测步骤全部试验过程均在IMMU1ITE全自动化学发光免疫检测系统上按预设程序自动完成，用时约50min（一步法）或80min（二步法）。以一步法为例，检测步骤如下：1 .依次在Testunit中加入待测标本或校正试剂+AP标记的抗原或抗体。2 .37温育3060min03 .高速离心除去未结合抗原或抗体。4 .离心洗涤3次。5 .加入发光底物，反应IOmino6 .光量子检测系统读取发光强度并经数据处理计算待测物质浓度。（四）资料保存及报告要求参见时间分辨荧光免疫分析。（五）质量控制见放射

9、免疫部分。（六）注意事项1 .应严格按照仪器说明书要求做好维护保养工作，保持管路清洁畅通。2 .系统对运行环境要求较高，应严格控制室内温度和湿度。3 .所有定标液、质控液、标本和testunit在操作前必须在2025C,试剂和标本应充分混匀。三、电化学发光免疫分析(e1SPECTrochemiIuminescenceimmunoassay,EC1IA)(一)原理电化学发光是一种在电极表面由电化学引发的化学反应，主要反应物质包括三联咄唬钉RuCbpy)3产和电子供体三丙胺(TPA)o在电场中的阳电极表面Ru(bpy)3产和TPA可同时失去一个电子而发生氧化反应，,二价的Ru(bpy)被氧化成三价

10、Ru(bpy)33,这是一种强氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA它很不稳定，可自发地失去一个质子，形成自由基TPAJ这是一种很强的还原剂，可将一个电子递给三价的Ru(bpy)3使其形成激发态的Ru(bpy)32*oRu(bpy)不稳定,很快发射出一个波长为62Onm的光子，回复成基态的Ru(bpy)J24%这一过程可以在电极表面周而复始地进行，仅消耗TPA,而作为标记物的Ru(bpy)3不被消耗,因此一个Ru(bpy)32+可产生许多信号光子，大大增强了信号强度。电化学发光免疫检测系统是以Ru(bpy)3产为标记物，标记抗原或抗体，通过免疫反应(反应方式类同于其他化学发光技术)

11、和电化学发光反应分析待测物的含量。现以Roche公司E1ecsys电化学发光系统为例加以说明。(二)试剂盒组成1 .校正试剂参见时间分辨荧光免疫分析。2 .标记抗原或抗体Ru(bpy)3产经N羟基琥珀酰胺酯(NHS)化学修饰后可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且Ru(bpy)3产NHS分子量较小，不易影响被标记物的免疫活性和可溶性。3 .生物素化抗体或抗原链霉亲和素(StrePtOaVidin,SA)和生物素(biotin,B)是具有很强的非共价特异性结合能力的一对化合物，一分子SA可结合四分子B,EIeCSyS的试剂中，抗体或抗原与活化的B结合，进而可

12、通过B与固相微粒表面的SA结合达到分离免疫复合物的目的。4 .固相载体固相载体是带有磁性的直径约2.8m的聚苯乙烯微粒，将SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在固相微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。5 .TPA溶液。6 .洗涤液。（三）检测步骤全部试验过程均在EIeCSyS全自动电化学发光免疫检测系统上按预设程序自动完成。以双抗体夹心法为例，检测步骤如下：1在试管中加入待测样品、Ru（bpy）31标记抗体、生物素化抗体，37。C反应5IOmino2 .加入SA磁性微粒，37。C反应510min,反应液输入流动池，磁性微粒在磁铁吸引下迅速沉积，附着在流动池底部的电极表面，其余反应液流出流动池，完成免疫复合物和游离成分的分离。3 .将TPA溶液送入流动池，将残存的游离成分排出流动池，使流动池中充满TPA溶液。4 .撤下磁铁，电极通电，Ru（bpy）3产与TPA发生电化学发光反应，发出的光被光电倍增管收集。5 .经换算得到待测物浓度。6 .向流动池中送入清洗液，彻底冲洗除去反应物，即可测定下一个标本。（四）资料保存及报告要求参见时间分辨荧光免疫分析。（五）质量控制见放射免疫部分。（六）注意事项1 .应严格按照仪器说明书要求做好维护保养工作，保持管路清洁畅通。2 .所有定标液和质控液在操作前必须在2025。（2。