质粒电泳,质粒DNA电泳三条带.docx

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1、质粒电泳,质粒DNA电泳三条带2023质粒电泳，质粒DNA电泳三条带正文内容质粒DNA电泳的三条带质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体.作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状.在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体.从宿主细胞中提取质粒DNA,是DNA重组技术中最基础的实验技能.分离质粒DNA有三个步鞭：1,培养细菌使质粒扩增2,收集和裂解细菌3,分离和纯化质粒DNA碱裂解法是较常用的提取的方法.其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产

2、物经纯化后可满足多数的DNA重组操作.此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性.由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分,甚至出现断裂.因此，当加入中和液时,溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时，质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性.在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀,而可溶性的质粒DNA留在上清夜中.在质粒提取过程中，由于机械力，酸碱度，试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂.所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA(CCCDNA)：质

3、粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA(OCDNA)：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA(IDNA):质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图质粒DNA的分子构型由于琼脂糖中加有嵌入型染料澳化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色.(a)松弛线性的DNA；(a)道中的SCDNA走在最前沿,0CDNA则位于凝(b)松弛开环的OC构型；(C)超螺旋的SC构型胶的最后边；(b)道中的1DNA是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OCDNA和SCDNA之间三，材料，试剂及器具1,材料E.Co1iDH5(pUC19vector)2,试剂1)1B培养基2

4、)TE缓冲液3)裂解液:溶液I,溶液,溶液HI4)酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)5)无水乙醇6)70%乙醇7)氨节青霉素50mgm1器具离心机，离心管，吸嘴四，操作步躲以1%比例把E.co1iDH5a(含PUC接种于含氨羊青霉素(AmP)IOogm1)的1B培养基中37C振摇过夜(12-18h)I取1.5m1培养物置离心管中IIoooOrPIn,离心InIin,或400OrPIn,离心5-10minI去上清，倒扣干净吸收纸上吸干I沉淀+1001溶液II加或不加入少量溶菌酶粉末；混匀，室温放置IOmin!+加2001溶液(新鲜配置)I温和颠倒数次,混匀，冰上放置5minI+1501溶液Inf

5、颠倒混匀，冰上放置15minI离心1200OrPm,15minI上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀，1200OrP1n,离心5minI小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质I上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10minI12000rpm,5min-15minI弃上清沉淀+1m170%乙醇I1200OrP1n离心5min-15minI弃上清；并倒扣离心管使液体流干1+自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜)I加501TE缓冲液(20gm1RNaseA)溶解质粒粗取物I-20C保存六，实验报告检查，保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因.七，思考题分析以下试剂的作用原理：溶液I：5OmmOI/1葡萄糖5mmo11trisHC1(Ph8.0)10runo11EDTA(PH8.0)溶液II：0.4mo11NaOH2%SDS使用前新鲜配制溶液15mo11Kac60m1冰醋酸11.5m1水28.5m1RNaseA酶：将粉末溶于10mmo11trisHC1(Ph7.5),15mmo11NAC1中，配成10mg/m1浓度的酶液，于100水浴加热15min,缓慢冷却至室温20C保存氯仿无水乙醇质粒电泳，质粒DNA电泳三条带正文内容结束。