40无菌试验检验规程.docx

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1、有限公司无菌试验检验规程XY1-Z1-40编制受控状态受控审核版本/状态A/0批准生效日期2023年02月28日序号修改内容修改人批准人修订日期1、目的：制定本司所有产品无菌检查操作规程。2、范围：适用于本公司产品无菌检查。3、职责：检验员负责实施，质量部经理监督实施。4、内容4.1 操作要求4.1.1 与供试液接触的所有器具应采用可靠地灭菌方法，置压力蒸汽锅内121C,30min。或置电热干燥箱内160C,2h04.1.2 超净工作台应符合局部洁净度100单向流空气区域要求。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取培养皿，无菌操作注入融化的培养基约20m1,在35C培养48

2、h证明无菌后取3支培养皿在超净工作台平均位置上打开上盖，暴漏30min后置35培养48h后取出检查，3支培养皿上生长的菌落数平均不应超过一个。4.1.3 无菌检查过程中应检查空气中的菌落数，方法同4.1.2.在试验开时打开培养皿盖，至试验结束后盖好置35培养，培养48h,结果应符合4.12要求。4.2培养基配制4.2.1硫乙醇酸盐流体培养基：称取硫乙醇酸盐流体培养基29.3g,加入蒸储水或去离子水11,搅拌加热至沸腾完全溶解，分装试管.121C高压蒸汽灭菌15min.4.2.2胰酪大豆陈琼脂培养基:称取胰酪大豆陈琼脂培养基40.0g,加入蒸僧水或去离子水11,搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶

3、，121,蒸汽灭菌15min.4.2.3胰酪大豆陈液体培养基：称取胰酪大豆陈液体培养基30.0g,加入蒸储水或去离子水11,搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，121,高压灭菌15min.4.2.4沙氏葡萄糖琼脂培养基：称取沙氏葡萄糖琼脂培养基65.0g,加入蒸储水或去离子水11,搅拌加热至完全溶解，蒸汽灭菌15min,冷却至50,倾入平皿。4.2.5沙氏葡萄糖液体培养基：称取沙氏葡萄糖液体培养基30.0g,加入蒸储水或去离子水11,搅拌加热至完全溶解，分装试管，121,高压灭菌15min.4.3培养基适用性检查4.3.1无菌性检查：每批培养基随即抽取不少于10支。5支置35C,另5支置25C培

4、养14天，均应无菌生长。4.3.2灵敏度检查：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代，（从菌种冷冻中心获取得的冷冻干燥菌种为第0代），试验菌应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌(StaPhy1OCoCCUSaureus)CMCC(B)26003铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CMCC(B)10104枯草芽胞杆菌(BaCiI1USsubti1is)CMCC(B)63501生胞梭菌(C1ostridiumsporogenes)CMCC(B)64941白色念珠菌(Candidaa1bicans)CMCC(F)98001黑曲霉(As

5、pergi11usniger)CMCC(F)980034.3.3菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆陈液体培养基中或胰酪大豆陈琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醉酸盐流体培养基中，30-35培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20-25培养2-3天，上述培养后的新鲜培养物用PH7.0无菌化钠-蛋白陈缓冲液或0.9*无菌氯化钠溶液制成每Iin1菌数小于IooCfU(菌落形成)的菌悬液。接种黑曲霉的培养物至沙氏葡萄糖琼脂面培养基上，20-25C培养5-7天，加人3-5m10.05%(m1m1

6、)聚山梨酯80的pH7.0无菌化钠-蛋白陈缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将袍子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出袍子悬液至无菌试管内，用0.05%(m1m1)聚山梨醋80的pH7.0无菌化钠-蛋白冻缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每Iin1抱子数量小于IOOcfu的抱子悬液。菌悬液若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8在24h内使用。黑曲霉抱子悬液存在2-8,在验证过的贮存期内用。4.3.4培养基接种：取每管装量为12m1的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于IOoCfU的金黄色葡萄糖球菌、铜绿假单胞菌、生袍梭菌各2支，另一支不接种，作为空白对照，培养三天；取每管装量为9m1的胰酪

7、大豆陈液体培养基7支，分别接种枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种，作为空白对照培养5天。逐日观察结果。4.3.5结果判定：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管菌生长良好，判定该培养基的灵敏度符合规定。4.4稀释液，缓冲液及其制备方法4.4.10.1%蛋白陈水溶液：取蛋白陈1Og,加水IOoom1,微温溶解，滤清，调节PH至7.10.2,分装，灭菌。4.4.2PH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液：称取磷酸二氢钾3.56g,无水磷酸氢二钠5.77g,氯化钠4.30g,蛋白豚1.00g,加水IoOom1,微温溶解，滤清分装，灭菌。4.4.30.9%氯化钠缓冲液：取氯化钠9.Og加水

8、溶解成IOOOm1,过滤，分装，灭菌。(仅用于上述两种溶液不适用时使用)4. 5方法验证试验4.1.1 菌种及菌液制备：同培养基灵敏度检查。4.1.2 薄膜过滤法：取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，滤膜孔径不大于045m,直径约为50mm,冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于IOOCfU的试验菌，过滤。加硫乙酸酸盐流体培养基或胰酪大豆陈液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养，培养时间不得超过5天，各试验菌同法操作。4.1.3 结果判定：与对照管比较，如含供试品各试管中试验菌生长良好，则说明供试品的改检验量在该检验条件下无抑菌作用

9、或其抑菌作用可以忽略不计，照此检验方法和检验条件下进行供试品的无菌检验。如含供试品的任一试管试验菌生长微弱，缓慢，或者不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，增加培养基用量，使用中和剂，或灭活剂，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。4. 6供试品无菌检查4.1.1 供试品数量：同一批号3-5个单位供试品。4.1.2 冲洗液：0.1%无菌蛋白陈水溶液，或其他符合中国药典的缓冲液和冲洗液。4.6.3供试液的制备：取规定量，每个最小包装用IooS20OmI冲洗液分别冲洗包装内、外，收集冲洗液于无菌容器中。在制备后2小时内使用。4.6.

10、4过滤，对照，培养，观察。4.6.4.1薄膜过滤：滤膜孔径不大于0.45Unh直径约为50mm,先将少量的冲洗液过滤,以润湿滤膜，将供试液过滤，再用200300m1冲洗液分次冲洗滤膜（每次约50m1）,1份滤器中加人IOOnII硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器中加入IOOmI胰酪大豆陈液体培养基。4.6.4.2阳性对照：以金黄色葡萄球菌作为阳性对照，置35培养72h应生长良好。4.6.4.3阴性对照：供试品无菌检查时应取相对应的稀释液，冲洗液，作为阴性对照，阴性对照不得有菌生长。4.6.5结果判定将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；培养期间应逐日观察并记录是否有菌生

11、长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。阳性对照管生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试管都澄清，或随显浑浊，但经确证无菌生长，判定供试品符合规定。若供试管中有任何显浑浊并确证有菌生长，则判定供试品不符规定。除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。试验若经确认无效，应重试，重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判定供试品符合规定，若有菌生长，判定供试品不符合规定。5 .相关文件中国药典2015GB-T14233.2-2005第二部分：生物学试验方法6 .相关记录成品无菌检验记录培养基适用性检查记录无菌检查方法验证报告