使用酶联免疫分析检测基本信息和结果解释注意事项等基础知识要点总结.docx

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1、使用酶联免疫分析检测基本信息和结果解释注意事项等基础知识要点总结使用酶联免疫分析（E1ISA）检测蛋白质是全世界最容易获得的诊断工具之一，该测试通常用于监控和疾病监测以及诊断工具。由于兽医经理们需要经常使用该方法，因此在解释结果前了解E1ISA检测的工作原理、检测的内容及其优缺点至关重要。检测基本信息E1ISA检测旨在检测针对细菌或病毒的抗原或抗体。抗原是刺激抗体产生的外来蛋白质（抗原二抗体生成剂）。在考虑抗体时，总是认为它们是针对蛋白质的。在设计检测方法时，制造商或实验室决定他们想要针对的特定蛋白质。如果E1JSA直接靶向细菌或病毒的蛋白质，则称为抗原E1ISA,而如果目标是动物对细菌或病毒

2、的抗体反应,则称之为抗体E11SA。尽管有设计成仅针对一种或两种蛋白质（抗体或抗原）的E11SA测定，但实际上许多E1ISA测定都针对大量蛋白质。还可以设计检测特定类型的抗体反应（IgG、IgM或IgA）或这些反应的组合。这些类型的抗体中的每一种都具有特定的功能，这不属于本文介绍的范围。通过E1ISA检测抗体或抗原的概念和过程完全相同。它从获得目标蛋白（抗原或抗体）开始。对于单个蛋白质，需要单独的方法来获得该单个蛋白质的纯化浓度。确定目标蛋白是一个科学而复杂的过程。理想情况下，该检测针对特定病原体的特有单一蛋白、高度免疫原性或高浓度；它靶向一种已知与疾病防护高度相关且始终存在的蛋白质。不幸的是

3、，这些标准中有许多是未知的，且可以容易地在样品中产生和发现这种单一蛋白质，或者多个蛋白质的混合物被用来替代。虽然使用全病毒或细菌作为目标蛋白可能很容易，但与其他病原体交叉反应的机会很多。检测过程的一般步骤如下（见图1）.步骤1：用目标抗原（用于检测抗体）或抗体（用于检测抗原）预涂微孔板。步骤2：添加样品测试并孵育，以使抗原和抗体之间发生附着。步骤3：移除样品，并添加附着在抗体相对侧的特定抗体。然后孵育样品以确保附着，并洗涤以确保去除任何非附着抗体或抗原。步骤4：添加用能发出荧光的检测器标记的抗体，并将其附着在步骤3中添加的特殊抗体上（附着在抗体部分的底部；抗原或抗体检测的目标相同）。然后再次孵

4、育样品以确保附着，并洗涤以确保去除任何未附着的标记抗体。步骤5：添加将触发残留的标记抗体荧光的试剂，然后进行孵育以确保附着。步骤6：读取样品，通常使用特定波长的专用机器来量化颜色变化（也被称为吸光度）。这一过程在检测方法是直接、间接还是夹心E1ISA方面有一些细微的差异，每种检测方法都有不同的优点和缺点,但最终结果相同；吸光度或颜色变化越高，测试样品中目标抗原或抗体的预期浓度越高。直接E1ISA：1 .将样品加入微孔2 .蛋白质附着于塑料上3 .偶联检测抗体与固E1ISA定化分析物结合4 .酶促显色反应与结合抗体成正比夹心E1ISA：1 .用捕获抗体预涂微孔2 .添加样品，分析物与捕获抗体结合

5、3 .偶联检测抗体与固定化分析物结合4 .间接检测，酶促反应与分析物成正比竞争E1ISA：1 .用第二捕获抗体预涂微孔2 .同时加入捕获抗体、偶联物和样品3 .偶联物和样品结合4 .酶促显色反应与结合偶联物成正比untargetedsamp1ematrix：非目标样本矩阵targetedana1yte:目标分析物antibody:抗体enzyme-conjugatedana1yte:酶偶联分析物biotin-streptavidinbinding:生物素-链霉亲和素结合enzyme-conjugated（APHRP）:酶偶联（AP/HRP）enzymaticsubstrate:酶底物co1or

6、reactionproduct:显色反应产物在竞争E1ISA的情况下，关键是所使用的过程实际上会产生相反的结果。将样品和已知量的标记抗原（用于抗原检测）或抗体（用于抗体检测）添加到待评估的样品中，以便一旦将它们添加到标记孔中，原始样品和添加的标记蛋白竞争附着在预涂孔上。本质上，如果待测样品中没有目标蛋白质，则所有标记的蛋白质将能够附着在平板上并产生强烈的颜色变化。另一方面，如果样品中有相当数量的目标蛋白质，则样品中的蛋白质将与标记的蛋白质竞争（阻止）结合。当洗涤样品时，任何未附着的标记蛋白将通过洗涤去除。因此，样本中的抗原或抗体越多，它们就越能阻挡标记的蛋白质，从而导致它们不附着并被洗掉。当样

7、品中目标蛋白的浓度高时，这会导致低吸光度，这与之前的情况相反。高值表示低浓度或阴性结果，无法量化阳性样品的抗原/抗体浓度。每个E1ISA测定的测定截止值可以不同，并且由制造商根据其期望的靶向敏感性和特异性预先确定。对于直接、间接或夹心E1JSA,任何高于截止值的数字都被视为阳性。对于竞争性E1ISA,任何高于临界值的数字都被视为阴性。对于某些分析，他们还建立了一个灰色区域，将样本分类为“可疑”，因为分析往往会有一些“背景”反应（交叉反应），这使得很难有一个明确的临界点。结果通常报告为校正的S:P或样本与阳性的比率，该比率根据阴性对照孔中发现的背景颜色变化进行校正。抗体水平通常被称为“滴度”。虽

8、然这在技术上是不正确的，但从宏观角度来看，它又是合理的。一个关键点是，当谈到滴度时，值之间存在直接的数学关系（值为20的样本的抗体数量是值为10的样本的两倍）。对于E1JSA值，不存在这种直接的数学关系（见图2A）o2.0的E1ISA确实比1.0的具有更多的抗体，但未必是1.0的两倍。合并用于测试的样本由于E1ISA测定是浓度依赖性的（与靶蛋白抗体或抗原的浓度直接相关），因此强烈建议不要合并进行检测。合并可显著增加丢失阳性样本的可能性。E1JSA测定的一些用途：检测是否存在针对目标病原体的抗体-抗体E1ISA-最常见用途确定病原体暴露确定动物的疫苗接种状态确定感染时间（抗体水平的变化）随时间的

9、变化。通过检测目标病原体的蛋白质/抗原来检测目标病原体的存在-抗原E1ISAE1ISA结果解释注意事项1、暴露于病原体（野生型或疫苗）的猪需要一段时间才能产生足够的抗体，以通过E11SA检测（通常应在暴露后至少2-4周，具体取决于病原体和靶向抗体）2、抗体E1ISA检测是无法区分母源抗体（被动抗体）与暴露于病原体而产生的抗体（主动抗体）。3、抗体E1ISA检测通常无法区分疫苗产生的抗体和野生型暴露产生的抗体4、在少数情况下，可以开发特殊的E1ISA检测，以区分感染动物和接种动物（D1VA疫苗）5、抗体E11SA结果并不意味着保护。保护可能来自不同的抗体,这些抗体可能无法通过检测或细胞介导的免疫

10、进行测量，而细胞介导免疫与体液或抗体介导的免疫力完全不同，并且不能通过E1ISA进行测量6、与PCR相比，抗原E1ISA在检测抗原的灵敏度方面明显较低（分析灵敏度较低）。PCR检测可有效复制存在的DNA/RNA,因此可检测极低水平的病毒或细菌。另一方面，抗原E1ISA需要显著更高浓度的病毒或细菌才能产生足够的颜色变化以使其能够被检测到。7、当使用商品E1ISA试剂盒时，结果是标准化的，并且在实验室之间通常是一致的。除非生产实践高度标准化，并严格遵循标准，否则猪场内部实验室E1ISA检测结果可能会产生很大的差异。8、并非所有病原体都会产生可测量的免疫反应9、每个E11SA试剂盒通常会测试不同的蛋

11、白质，这可能会对同一样本产生截然不同的结果。一个值得注意的例子是，猪支原体抗体E11SA试剂盒存在许多差异；当然，并非所有试剂盒都是用同样的方法生产的。10、暴露剂量和/或途径可能影响免疫反应水平（抗体产生水平）11、重要的是了解检测的灵敏度（检测真阳性的能力）和特异性（将真阴性识别为阴性的能力；无交叉反应）12、可能会出现假阳性和假阴性结果，因为个体猪的接触剂量和对病原体的免疫反应不同（正态分布），并且通常存在一些无法完全消除的背景或交叉反应（见图1）13、抗体通常在接触/接种后几个月内保持存在/可测量阴性结果解读：1、样本/群体对病原体真正阴性（未接触过且未接种疫苗）2、尽管动物可能接种了

12、疫苗，但样本猪群对病原体确实呈阴性（如果检测具有DIVA能力）（仅限抗体E1ISA）3、样本中没有足够的抗原用于检测（仅限抗原E1ISA）4、在疾病早期采集样本，猪尚未产生可检测的免疫反应（仅抗体E1ISA）。猪繁殖与呼吸综合征通常需要7-10天才能发生血清转化。胞内劳森菌感染通常需要4-6周才能发生血清转化，具体取决于暴露剂量5、采集样本的时间太晚，病原体不再存在。流感病毒仅在感染的前3-4天出现在鼻分泌物中6、靶向抗体/抗原错配。不同的流感病毒株（HIN1和H3N3之间的差异，以及H1N1不同分支之间的差异）7、猪群中的流行率低，且采样的动物未受感染。需要增加动物样本数量8、特定疾病可能没

13、有刺激产生足够的抗体进行检测。猪肺炎支原体主要附着在肺纤毛上，不会刺激产生大量的血清IgG最近的田间感染产生了更强的E1ISA结果猪肺炎支原体疫苗不会刺激强烈的IgG免疫反应不同的E1ISA检测以不同方式检测疫苗通常只有大约30%的接种动物会发生血清转化由于合并而稀释弱阳性样本9、强烈反对合并样本！阳性样本解读：1、样本/猪群对病原体暴露真正呈阳性2、无法区分样本是否具有传染性或非传染性3、无法将母源抗体与自然暴露或接种而产生的抗体区分开来O大多数母源抗体会在8-12周龄时消失。随着猪日龄的增长，E11SA值应随时间显著降低。随着时间的推移，可以对猪进行检测，以确认母源抗体衰退以及缺乏田间暴露

14、（没有新的感染）4、根据目标病原体，蛋白质（抗原/抗体）的检测并不总是能确认疾病。检测猪圆环病毒2型（PCV2）血清抗体EIJSA呈阳性，证实了接种疫苗或感染动物（两者都很常见）暴露于PeV2,但不能确定消瘦或疾病是否归因于PCV2或是否发生了疫苗失败。需要对肺和/或淋巴组织进行免疫组织病理学检查，以证明与PCV2相关的疾病。检测可能无法区分暴露于疫苗病毒/细菌、改良活疫苗和野生型感染（仅抗体E11SA）5 .适用于灭活疫苗和改良活疫苗6.有助于了解疫苗使用的时间，尽管不是关键，因为动物可能在很长一段时间（许多月）内对某些疾病保持阳性7、交叉污染不太可能，因为需要大量污染才能产生阳性结果（取决

15、于浓度）8、单个E1ISA值可能无法完全确定感染阶段（需要临床病史）oX=E1ISA值爆发中的三个不同点可以产生相同的E11SA值，但所需的解释和行动会完全不同：A点一一感染初期一一爆发开始；可采取相应措施B点一一感染晚期一一疫情即将结束；在这一时间点上没必要采取任何措施C点一一第二次爆发一一第二次爆发正在开始，必须解决生物安全措施/重新爆发的原因0可能需要在10天至2周后从同一动物上第二次采集样本，以进一步确定暴发的阶段（以及临床病史）如果第二个样本结果较高，则可能在点A如果第二个样本结果显著较高，则可能在C点如果第二个样本结果不发生变化，则可能处于平稳阶段如果第二个样本结果下降，那么很可能在B点9、高S:P值通常与最近的暴露有关o尤其是在第二次暴露或加强免疫接种后（见图2）（仅抗体E1ISA）。重要的是要注意，仅仅因为感染是最近的，并不意味着病原体仍然存在（仅限抗体E1JSA）猪繁殖和呼吸综合征（PRRS）病毒尤其如此。猪可以是E11SA阴性，但仍然是病毒血症猪可以具有高抗体EIJSA值，但不是病毒血症PCR检测用于确定动物的病毒血症状态10、低S:P值o特定疾病可能不会刺激足够的抗体进行检测猪肺炎支原体主要附着在肺纤毛上，不刺激产生高血清IgG最近的田间感染产生了更强的E1ISA结果猪肺炎支原体疫