禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法.docx

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1、禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法1、范围禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法，适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测。2、缩略语缩略语：荧光RT-PCR,荧光反转录-聚合酶链反应。Ct值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。RNA,核糖核酸。DEPC,焦碳酸乙二酯。PBs,磷酸盐缓冲盐水。Taq酶，TaqDNA聚合酶。3、原理禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位于引物结合区域内。探针的5端和3端分别标记不同的荧光素，如5端标记FA

2、M荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示），3端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核甘酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探面结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5-3外切核酸酶的功能，将探针水解成单核昔酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的

3、R基团游离出来，所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。4材料与试剂4. 1仪器与器材荧光RT-PCR检测仪高速台式冷冻离心机（离心速度12000rmin以上）台式离心机（离心速度3000rmin）混匀器冰箱（2“8和-20两种）微量可调移液器（IO1、IOOu1.IoOOU1）及配套带滤芯吸头Eppendorf管（1.5m1）4. 2试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。氯仿：异丙醇：-20。C预冷；PBS

4、：1212oC,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各IoOoOUm1;75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB6682-92要求）配制，-20C预冷；禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒。5抽样5. 1采样工具下列采样工具必须经（1212）t,15min高压灭菌并烘干：棉拭子、剪刀、镜子、注射器、1.5m1Eppendorf管、研钵。5.2样品采集5. 2.1活禽取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：一取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颗裂来回刮3次5次取咽喉分泌液；一取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；-将拭子一并放入盛有1.Om1PBS的

5、1.Sm1Eppendorf管中，加盖、编号。5. 2.2肌肉或组织脏器待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号，送实验室。5. 2.3血清、血浆用无菌注射器直接吸取至无菌EPPendOrf管中，编号备用。5. 3样品贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封送实验室。6. 4样品制备7. 4.1咽喉、泄殖腔拭子样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镀子将拭子中的液体挤出，室温放置30min,取上清液转入无菌的1. Sm1Eppendorf管中,编号备用。5. 4.2肌肉或组织脏器取待检样品2.Og于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加IOm1

6、PBS混匀，4,3000rmin离心15min,取上清液转入无菌的1.5m1Eppendorf管中，编号备用。6. 5样本存放制备的样本在2七8条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置-70。C以下，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）O6操作方法7. 1实验室标准化设置与管理禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的实验室规范。6.2样本的处理在样本制备区进行。6.2.1取n个灭菌的1.Sm1Eppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照阴性对照在试剂盒中已标出），编号。6.2.2每管加入600U1裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200U1,一份样本换用一个

7、吸头，再加入2001氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于49、12000rmin离心15mino6.2.3取与6.2.1相同数量灭菌的1.Sm1Eppendorf管，加入5001异丙醇（-20C预冷），做标记。吸取本标准6.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500u1,不能吸出中间层，颠倒混匀。6.2.4于4、12000rmin离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）；加入600175%乙醇，颠倒洗涤。6.2.5于4、12000r

8、min离心IonIin（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。6.2.64000rmin离心IOS（EPPendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，空温干燥3min,不能过于干燥，以免RNA不溶。6.2.7加入I1U1DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA,2000rmin离心5s,冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70。C冰箱。6.3检测6.3.1

9、扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000rmin离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见下表。表每个样品测试反应体系配制表试剂用量RT-PCR反应液151Taq酶0.25U1根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积中，向其中加入0.25n颗RT-PCR反转录酶颗粒，充分混合均匀，向每个荧光RJPCR管中各分装15u1,转移至样本处理区。6.3.2加样在样本处理区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤6.2.7中制

10、备的RNA溶液各IOU1,盖紧管盖，500rmin离心30so6.3.3荧光RT-PCR检测在检测区进行。将本标准6.3.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：第一阶段，反转录42oC30min;第二阶段，预变性92oC3min;第三阶段，92oC10s,45oC30s,72oC1min,5个循环；第四阶段，92oC10s,6030s,40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。7结果判定7.1结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。7.2质控标准7.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。7.2.2阳性对照的Ct值应28.0,并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。7.3结果描述及判定7.3.1阴性无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒。7.3.2阳性Ct值30的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。