猪链球菌2型抗体的检测酶联免疫吸附法.docx

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1、猪链球菌2型抗体的检测酶联免疫吸附法1范围本文件规定了猪链球菌2型抗体的酶联免疫吸附法检测技术操作程序。本文件适用于猪链球菌2型抗体的检测和猪只接种猪链球菌2型疫苗后的免疫效果评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范（2003年10月15日农业部第302号公告发布）。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。31酶联免疫吸附试验enzyme-1inkedImmunosorbentAssay(E1ISA)

2、将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过E11SA检测仪进行定量测定，从而测定抗体或抗原含量。光密度Optica1Density(OD)测量被检测物吸收掉的光以及有多少光穿过了这个物体。抗原antigen是指能被免疫细胞识别，使免疫细胞活化发生免疫应答,并能在体内或体外与相应的免疫应答产物（抗体或效应T

3、细胞）发生特异性结合的物质。34抗体antibody机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。4原理在固相载体微孔板上预包被纯化的猪链球菌2型特异性抗原，当被检血清中含有猪链球菌2型抗体时，抗体与微孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与羊（兔）抗猪免疫球蛋白G（IgG）酶标记物反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物颜色反应判断结果,检测猪链球菌2型抗体水平。5试齐U- -预包被猪链球菌2型抗原的微孔板；- -血清稀释液；- -猪链球菌2型阳性对照血清；- -猪链球菌2型阴性对照血清；- -羊(兔)抗猪免疫球蛋白G(IgG)酶(HRP)标

4、记二抗；- -显色液A；- -显色液B；终止液:硫酸(H2SO4)溶液(2mo11);- -10X浓缩洗涤液；- 样品稀释液；-商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒，比如猪链球菌2型抗体检测试剂盒。6器材-微量移液器（量程10u1、1001200u1、10001）；- -多道可调移液器（量程303001）；- -一次性移液器吸头；- -振荡器；- -酶标仪（含45Onn1波长滤光片）；- 37恒温培养箱或水浴箱；- 100m1、1000m1量筒；-离心机；-封板膜；-一次性乳胶手套、口罩，护目镜；-吸水纸巾；-一次性采血器（最大量程5m1或IOnI1）。7试验样品的准备71血液样品采集与处理

5、采血方式为前腔静脉或耳静脉无菌采血。将生猪绑定好后，用碘酊消毒采血部位，再用75%酒精棉球二次消毒，最后用脱脂棉球拭干，使用5m1或IOnI1一次性采血器采集不少于2m1的非抗凝性全血。室温下倾斜静置2h,待血液自然凝固后，放置28冰箱中不少于2h,4000r/min离心IOmir1,使用IOOOU1量程的移液器小心吸出上层血清。7,血清样品保存与运输血清样品若在分离后一周内完成检测，可置于28条件下短期保存；若超过一周后检测，应置于-20及以下冷冻保存。血清样品运输时，按照兽医实验室生物安全技术管理规范（2003年10月15日农业部第302号公告发布）进行样品的生物安全标识,应用恒温箱加冰袋

6、或干冰密封等方式冷藏运输，运输时间应尽量缩短，确保血清样品有效。8操作方法将IOX浓缩洗涤液恢复至室温，摇匀，然后用蒸储水或去离子水作10倍稀释，PH调至7.4。一样品稀释将已分离好的待检猪血清样品用样品稀释液做1:10稀释，即取501样品加到4501样品稀释液中,并充分混匀。A1操作步骤8.3.1 酶标板上阴阳性对照和待检样品的分布（见表1）。在A1、BI加入阳性对照，1001孔;CKD1加入阴性对照，IOO1孔；EKF1加入空白对照，IOO1/孔;GKH1等其余孔加入稀释好的待检样品，1001/孔。表1加样记录表（推荐模式）123456789101112APS3BPS41234567891

7、01112CNS5DNS6EBS7FBS8GS1S9HS2S1O注:P一阳性对照孔N一阴性对照孔B一空白对照孔SKS2、S3等一待检样品孔，其余类推。8.3.2 用封板膜覆盖板条,置37恒温箱或水浴箱中孵育2h。8.3.3 弃净孔中液体，用力拍干，加入稀释好的洗涤液3001孔，静置InIin后弃净、拍干，如此反复洗板3次。8.3.4 除空白对照外，其余加入酶标记物501孔，置37孵育1ho8.3.5 重复步骤8.3.3。8.3.6 3.6重复步骤8.3.3o8.3.7 加入终止液501孔，混匀后避光作用IOmin,终止反应后20min之内，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。8.3.8 计算

8、S/P值（被检血清0怯5。向值一阴性对照0D450nm值）/（阳性对照0D450m值一阴性对照0D450nm值）。R4试验成立条件阳性对照0D450nm值大于0.6,且阴性对照OD45nm值小于0.3,试验成立；否则，试验不成立，需重新试验。A弓结果判定8.5.1 如样品S/P值20.60时，判为猪链球菌2型抗体阳性。8.5.2 如样品S/P值V0.60时,判为猪链球菌2型抗体阴性。8.5.3 若采用商品化试剂盒，应根据说明书进行操作及结果判定。9注意事项M所有操作应严格遵守兽医实验室生物安全规定；力用于加样的移液器应定期进行校准，以免产生误差影响检测结果的准确性；Q,I10倍浓缩洗涤液在低温

9、保存时可能会产生白色结晶，应加热使其溶解后再使用；94酶标记物溶液和终止液对呼吸道、眼睛及皮肤有刺激作用，使用过程中应穿戴口罩、护目镜、手套等防护用具，防止直接接触和吸入；一酶标记物溶液应避光保存，避免与氧化剂接触，盛装底物溶液的容器应保持洁净；Q6所有试剂均应按照要求进行保存，使用前恢复至室温；97血清稀释板的微孔只能使用一次。同步进行多板检测时，反应板不宜叠放在37温箱中，宜将反应板平放于湿盒内或覆盖封板膜后直接平放于温箱中，但不宜采用密封袋，避免反应板受热不均。附录A（资料性）溶液的配制A.1显色液A显色液A按下列配方进行配置：四甲基联苯胺(C6H22CI2N2)：0.2g；二甲基亚碉(

10、DMSO)：8.0m1；加蒸储水：定容至1000m1；在800m1蒸储水中溶解上述各种成份，加蒸储水定容至1Ooom1室温保存。A.2显色液B显色液B按下列配方进行配制：磷酸氢二钠(Na2HPO4)：14.60g；柠檬酸(C6H8O7,分析纯)：9.33g；0.75%过氧化氢尿素(CH4N2OH2O2)：6.4m1；加蒸储水：定容至1000m1；在800m1蒸储水中溶解上述各种成份，用1mo1/1盐酸调节溶液PH至5.0,加蒸储水定容至1OOOm1室温保存。A.3终止液将27.8m1浓硫酸缓慢滴加入30OnI1蒸储水中，边加边搅拌，补充蒸储水至1000m1。A.4IOX浓缩洗涤液IOX浓缩洗涤

11、液按下列配方进行配制：氯化钠(NaC1)：8.0g；磷酸二氢钾(KH2PO1)：0.2g；磷酸氢二钠(Na2HPO4120)：2.9g；氯化钾(KC1)：0.2g；吐温-20：5.0m1；硫柳汞：0.1g;蒸播水：定容至100m1；在80m1蒸储水中溶解上述各种成份，用1mo1/1盐酸调节溶液PH至7.4,加蒸储水定容至IOOm1。室温保存。A.5样品稀释液样品稀释液按下列配方进行配制：磷酸盐缓冲液(0.0InIoI/1pH8.0)：956.0m1；甘油:40.0m1；酪蛋白：20.0g；硫柳汞钠：0.1g;吐温-20：1.0m1；在956m1磷酸盐缓冲液中溶解上述其余成份。室温保存。A.6磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液按下列配方进行配制：氯化钠(NaC1)：8.0g；磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.2g；磷酸氢二钠(Na2HPO412H20)：2.9g；氯化钾(KC1)：0.2g；蒸播水：定容至1000m1；在80Om1蒸储水中溶解上述各种成份，调节溶液PH至&0,加蒸储水定容至IoOOm1室温保存。