IL－1β酵母发酵条件的优化 优秀专业论文.docx

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1、ILIB酵母发酵条件的优化目录前言1-1白细胞介素-1的生物学活性1.2 白介素-1的发现及其结构1.3 白细胞介素邛的基因工程研究1.4 IL一邛的应用材料与方法2.1实验材料2-L1器材及设备2.L2主要试剂和溶液2.2实验方法2.2.1 毕赤酵母大规模表达人源IL邛条件的优化222培养基成分、细胞密度、溶氧值等条件的优化1012毕赤酵母大规模表达人源IL-ip结果12培养基成分对IL-ip发酵表达产量的影响13结果与讨论13温度对IL-ip发酵表达产量的影响3.4甲醇流加速度对IL-ip发酵表达的影响13摘要溶解氧对IL-lp发酵表达产量的影响1414参考文献15致谢171前言1.1 白

2、细胞介素-1的生物学活性IL-1是一种重要的细胞因子，具有广泛的生物学活性。不仅对多种免疫活性细胞有重要调节作用，而且参与造血、神经内分泌及抗肿瘤等多种生理过程1,并与发热、炎症以及某些疾病的病理变化有关。IL-1对正常细胞有细胞毒性作用,其IL-1水平的升高可见于败血症、风湿性关节炎、白血病和糖尿病等。IL-la和IL-1|3还可导致发热。1L.1参与介导炎症反应，是重要的炎症介质，能促进骨髓释放中性粒细胞，诱导单核细胞和多核细胞趋化浸润到炎症局部，在局部释放溶酶体酶；IL-1还具有破坏结缔组织的作用2,能诱导成纤维细胞增殖，并能诱导上皮细胞、成骨细胞产生胶原蛋白，诱导破骨细胞、成纤维细胞和

3、软骨细胞等释放胶原酶分解胶原蛋白，并能促进骨质吸收，促进平滑肌细胞增殖。IL-1可诱导内皮细胞表面因子的合成，并活化内皮细胞。在肝脏中，IL1可使肝蛋白的合成增加，并减少白蛋白的生成。IL1还可诱导胶原酶的生成，并对中性粒细胞有趋化和刺激作用，它还可以影响内分泌系统，促进B淋巴细胞的有丝分裂。在机体免疫功能中IL-1处于非常重要的地位，它能够活化巨噬细胞、NK细胞和T细胞，并可诱导B细胞的增殖和成熟，以及诱导LAK细胞的产生。IL-I还可以诱导纤维原细胞的增殖，诱导金属蛋白酶的表达，导致细胞外基质的降解，单核细胞的迁移，以及降解ILJ0,这是一个负反馈机制。IL-1对代谢也有较大的影响2,它能

4、参与恶液质的形成，有致负氮平衡的效应，可刺激骨骼肌细胞分解蛋白质；它还具有降低血糖的作用，这与它能刺激胰岛素分泌、增强胰岛素的活性和促进葡萄糖转运到胞浆有关。并且IL-1对血浆中的微量元素也有影响，包括引起铜离子增加和锌离子、铁离子的减少。另外IL-1在免疫细胞的激活中也发挥着重要作用，它可以作用于巨噬细胞和单核细胞，诱导其产生对肿瘤细胞的细胞毒活性，并且还能够促进原始骨髓造血干细胞的集落增殖，同时能够促进人体其他细胞释放造血生长因子而促进造血。依据以上机理，国外试用IL-甲治疗肿瘤以及治疗高剂量化疗和同源骨髓移植后4, 5促进造血功能恢复的临床I期试验。1.2 白介素-1的发现及其结构IL-

5、1最初于19世纪40年代发现于急性粒细胞性渗出液中，是一种对热不稳定的蛋白质，正常情况下，除皮肤角质细胞、某些上皮细胞和中枢神经系统细胞外，其它细胞均不表达IL-lmRNA,但在感染、微生物毒素、炎性因子、激活的淋巴细胞产物、补体和凝血因子等的刺激下，几乎所有核细胞均可产生ILJ,主要有髓样细胞（单核细胞、各种巨噬细胞、滑膜细胞和朗格罕斯细胞等）和淋巴细胞（B细胞和B细胞淋巴瘤细胞株、辅助性T细胞、大颗粒淋巴细胞和NK细胞）等。有两种形式的IL-1,即IL-la和IL-lp,其基因均位于第2号染色体上。两种形式的IL-1均首先被合成31kD的前体（proIL-l）, pro-IL-1被蛋白酶分

6、解为17kD的肽，称为成熟IL-1。成熟IL-la和IL-甲是IL-1的生物学活性形式。健康人的中枢神经细胞、一些上皮细胞和皮肤的角化细胞可分泌IL-la。而在炎性物质、感染或细菌内毒素的刺激作用下，巨噬细胞和一些其它类型的细胞也可产生IL-la。通常情况下，在循环中很难检测到IL-la,但在严重疾病状态下，死亡的细胞释放细胞因子后可检测到它。结肠组织中IL-la的水平与炎性肠病的严重程度有关。白介素-1的另外一个形式ILJ0可以调控局部或系统的急慢性炎症。IL-ip可由单核细胞、巨噬细胞、星形胶质细胞、肾上腺皮层细胞、NK细胞、内皮细胞、角化细胞、血小板、神经细胞、中性粒细胞、滋养层细胞、纤

7、维原细胞等产生，并且它可以对几乎每一种类型的细胞均产生影响。是一种生长抑制剂，对黑素瘤细胞具有杀细胞作用。IL/p可抑制胰岛素的释放，减少胰岛素和胰高血糖素的含量，因此它可用于对胰岛素依赖型（I型）糖尿病的治疗。IL-甲还可刺激骨的再吸收，抑制骨胶原质的合成。尽管二者仅有25%的氨基酸同源性，但它们激活同样的受体，产生同样的生物学活性6。IL-la和IL-lp的三维结构也极为相似，以IL-lp三维结构为例如图1.1所示，其中12个（3一折叠构成了 IL-1的空间结构。图1.1 IL-1的空间三维结构FigJJ The 3-D structure of IL-1 protein1.3 白细胞介素

8、.邛的基因工程研究鉴于天然资源中提取白介素成本高，得率低，工序繁，因此利用基因工程的方法来生产白介素是降低成本的一条有效途径。有关白细胞介素甲基因的表达研究最初是在原核表达系统中进行的，与IL-la不同，IL-甲则可以分泌到细胞外。但是由于IL-邛缺乏信号肽，不能通过高尔基体-内质网的经典途径分泌，已有的研究认为IL-1P可能是通过膜通道到达细胞外，但其真正的分泌途径迄今仍不清楚。IL.甲前体因为缺乏疏水的氨基酸序列而只能被保留在胞浆中，当其被特异性半胱氨酸蛋白酶即IL-10转换酶(IL10 converting enzyme, ICE)切割后,形成成熟的IL-ip,后者转送至细胞外后发挥多样

9、的生物学活性。在体内有多种不同类型的细胞可以合成分泌IL-1,如嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞，B淋巴细胞，T淋巴细胞，表皮细胞等。但其主要来源仍是血中的单核细胞和组织中的巨噬细胞。正常人的很多组织中均可表达低水平的IL-不。多种刺激如细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),众多的微生物的产物，细胞因子(包括肿瘤坏死因子、干扰素2丫、粒巨噬细胞集落刺激因子、IL-2等），以及免疫复合物等均可促进IL.10的分泌。在一些与外界病原体接触较多的组织和器官中，如呼吸道、胃肠道，淋巴组织如肝、脾等，IL-1的表达高于其他组织。病理情况下，尤其是炎症反应及免疫应答时，IL-1往往过量表

10、达。其他的病理情况如缺血/再灌注损伤，类风湿性关节炎10,以及某些神经系统疾病如Alzheimer病患者的血清和脑脊液中也可以见到IL-甲升高11。ILla和ILJ0都存在于内膜的上皮和基质细胞内，在月经、黄体形成等过程中，IL-1会发生周期性的变化，提示雌孕激素可能对IL1的表达有调节12。此外，Gemma等13发现肾上腺皮质酮对小鼠大脑中的IL-1表达也有增强作用。由此可见，细胞外激素可能会影响IL-1的表达。IL-甲转录和翻译的不连续性是其区别于其他的蛋白质特点之一。大部分的IL-电转录产物均被降解，即使连接到核糖体上也没有肽链的延伸。但在细胞内添加细菌内毒素或是1L-1后，其翻译速度就

11、大大提升，其原因可能是LPS刺激了 IL-l|3mRNA的3,端腺甘酸、鸟喀咤（AU）富含区。ICE是IL-ip成熟的关键酶，其切割的位点是IL-ip前体116位点的天门冬氨酸，若其被其它氨基酸所替代或ICE功能异常均可影响IL-ip的表达。IL-1基因的多态性可能也是其表达调控的重要机制之一。Pociot（1992年）发现在LPS的诱导下IL-lp基因+3953位点为T时，单核细胞可表达更高水平的ILJ0蛋白，且具有剂量依赖性。但Santtila等（1998年）发现携带ILJ0基因2511位点为T及+3953位点为C时的单核细胞虽也可以使IL-ip表达有所增加，但均无统计学意义，而突变型IL

12、-1RA*2基因可以明显提高体外培养的外周血单核细胞分泌IL-电的量。二者结果不同原因可能在于所用的刺激物不同，引起IL-甲基因活化途径的差异。同时Roberto等14也发现LPS刺激后，人外周血单核细胞是否携带有IL-1P+3953位点C/T等位基因并不影响IL-ip表达量。这些结果的分子机制目前尚不清楚。必须注意的是，IL-1基因簇各基因型和等位基因频率在不同的种族，地域、疾病的人群中分布特点不一致，这是由于不同种族和地区的人群发生了基因漂移。所以要将某一群体中的基因多态性分布特点推论到其他群体是需要非常谨慎的。现在已经有国内报道采用原核表达的方法生产IL.lp,但是对于采用真核表达的报道

13、没有，真核与原核表达相比交可能成本和投入会更大。本研究就是想尝试摸索酵母发酵的一些条件来达到降低成本，提高产率的目的。1.4 IL-lp的应用白介素1伙比甲）是一个具有广泛生物学活性的细胞因子，它可促进胸腺细胞、T细胞、B细胞的活化、增殖和分化；促进免疫球蛋白的合成与分泌；并且刺激骨骼干细胞的增殖；在炎症反应中刺激单核细胞和巨噬细胞分泌促炎介质15。由于ILJ。在免疫应答和炎症反应中发挥这重要的功能，已经有多种哺乳动物（如绵羊、马、猪、奶牛等）的重组IL-甲被用作免疫的免疫佐剂16。但是，目前只有少数研究对体外表达人的IL甲的生物学活性进行鉴定。所以本研究通过筛选具有高表达IL-甲效果的酵母，

14、并选择大规模发酵表达的最佳条件，从而能够获得尽可能多的产品，为以后做其生物学活性进行鉴定和免疫佐剂的研制奠定基础。首先，IL-1|3本身自己在生理状态下表达水平极低，但是它在中枢神经系统的生长和发育调节中起到至关重要的作用，而且在脑创伤、缺血、神经退行性疾病时IL10的表达明显上调。据报道，IL10还是星形胶质细胞有效的分裂原，可以促进大鼠星形胶质细胞的增殖17；除了 IL-ip,谷氨酸（glutamate, Glu）是哺乳类动物中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，在中枢神经系统损伤或疾病时细胞外谷氨酸增加。谷氨酸也可诱导星形胶质细胞增殖。在这样的思路指引下，国内的相关研究人员研究IL.甲和Gl

15、u联合应用对星形胶质细胞细胞周期的影响，并得到这样的结果：（1）不同浓度的IL10可使星形胶质细胞S和G2/M期的细胞指数较对照组增高，在一定范围内随着IL-电浓度的增加，星形胶质细胞的增殖更明显，同一浓度的IL-甲其作用随着时间的延长而逐渐衰减，（2）IL-1。与Glu联合应用较IL-lp单独应用星形胶质细胞的增殖更明显即IL-甲激活星形胶质细胞，并启动细胞周期进程，促使星形胶质细胞增殖；ILJ0与Glu在诱导星形胶质细胞增殖时有一定的协同作用18。IL-ip作为人体内重要的炎症因子，它与众多的疾病有着千丝万缕的联系，比如IL-甲可导致缺血性脑损伤。目前，IL-甲在缺血性脑损伤中的具体作用机制还不十分明确，可能通过以下途径：（1）介导黏附分子ICAM-1表达上调，白细胞聚集，引起血管炎性反应；（2）使磷脂酶A2增多，磷脂过度降解，直接引起细胞膜损伤；（3）使局部兴奋性