细菌病毒真菌分离及鉴定方法与流程销毁记录.docx

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1、附录A（规范性）细菌分离及鉴定方法与流程A.1分离培养基的选择A.1.1总体要求选择适当的分离培养基是细菌分离培养中关键的一环，采集的标本送往细菌实验室后，根据标本来源、培养目的、分离的目的菌种类等，应立即接种到适当的分离培养基上。A.1.2培养基种类A.1.2.1血平板:适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都可接种此平板。A.1.2.2巧克力血平板:其中含有V和X因子，适于接种怀疑含有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。A.1.2.3中国蓝平板或伊红美蓝平板:可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进革兰阴性细菌生长，是较好的弱选择性培养基。发酵型革兰阴性杆菌因分解乳糖能力不同，在此平板上菌落颜色不同，

2、便于鉴别菌种。A.1.2.4麦康凯平板:具中等强度选择性，抑菌力略强，有少数革兰阴性菌不生长。在麦康凯平板上能否生长，是不发酵菌鉴定的一个依据。A.1.2.5SS琼脂:有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强，可影响检出率，所以，使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。A.1.2.6碱性琼脂或TCBS琼脂:用于分离霍乱瓠菌及其他弧菌。A.1.2.7血液增菌培养基:用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。A.1.2.8营养肉汤:用于标本及各类细菌的增菌培养。A.2细菌的培养条件A.2.1总体要求细菌的生长繁殖需要提供合适的环境条件,不同种类的细菌，生长繁殖的条件不完全相同，个别种类细菌要求

3、特殊的环境条件。但其基本环境条件包括酸碱度、温度、气体、渗透压等方面。A.2.2具体要求A.2.2.1酸碱度a）大多数细菌最适的酸碱度为pH7.27.6,在此PH下,细菌的酶活性强，生长繁殖旺盛。b）个别细菌如霍乱弧菌在pH8.49.2的碱性条件下生长最好。c）结核分枝杆菌在pH6.56.8最适宜。d）细菌代谢过程中分解糖类产生酸，pH下降，不利于细菌生长。A.2.2.2温度a）大多数细菌生长最适温度为37Cob）个别细菌如鼠疫杆菌在28C30的条件下生长最好。c）嗜热菌能在50C60C下生长，海洋细菌嗜低温,可在030条件下生长。A.2.2.3气体a）多数细菌在代谢过程中需要二氧化碳，但分解

4、糖类产生的二氧化碳已足够所需，且空气中还有微量二氧化碳，不必额外补充。b）少数细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等在初次分离培养时,必须供给5%10%的二氧化碳才能生长。A.2.2.4渗透压a）一般培养基的盐浓度和渗透压对大多数细菌是安全的。b）少数细菌如嗜盐菌需要在高浓度的氯化钠（3%）环境中生长良好。A.3细菌的鉴定A.3.1形态学鉴定取液体培养的细菌10微升，用生理盐水稀释不同浓度，显微镜下观察单个细菌的大小、形状、运动性、鞭毛等。A.3.2革兰染色鉴定革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法如下：a）制片取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期培养物作革兰

5、氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。b）初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1min-2Inirb水洗。c）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,水洗。d）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。乙醇脱色是革兰染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20S30Soe）复染：用番红液复染约2Inin,水洗。f）镜检：干燥后，用油镜观察.菌体被染成蓝紫色的是革兰阳性菌，被染成红色的为革兰阴性菌（

6、A.3.3细菌的生理化学鉴定A.3.3.1糖（醇）类发酵试验在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号。取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。将已接种好的培养基置32温箱中培养24hoA.3.3.2甲基红试验（M.R试验）将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白陈水培养基中,32培养24h,加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。A.3.3.3伏-普试验（V-P试验）将被检菌接种到葡萄糖蛋白陈水中，32培养24h

7、,取出，加入40%KOH7滴，然后再加入等量的5%a-蔡酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保温30min,以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏-普反应阳性。A.3.3.4靛基质（口引噪）试验将被检菌接种到胰蛋白陈水培养基中，32C培养24h后，滴加数滴叫咻试剂于培养物液面，轻轻摇动，观察结果。出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。A.3.3.5硫化氢试验将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，32C培养24h,观察结果，若有黑色出现者为阳性。取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置32培养24小时。故观察结果时，应将明胶培养基轻轻

8、放入4C冰箱30min,此时明胶又凝固。若放置于冰箱3Omin仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。A.3.3.7柠檬酸盐利用试验取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，32C培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。A.3.3.8淀粉水解试验在培养进表面滴加碘液，观察是否变紫。结果判定见表A.1细菌生理化学鉴定结果判定表。表A.1细菌生理化学鉴定结果判定表编号大肠杆菌枯草杆菌产气杆菌变形杆菌空白对照葡萄糖发酵实验有气泡无气泡无气泡乳糖发酵实验有气泡无气泡无气泡甲基红试验红色红色黄色伏-普试验黄色黄色黄色咧噪试验无结果无结果无结果硫化氢试验白色固体沉淀白色固体沉淀白色固体沉淀明胶液化

9、试验未液化未液化未液化柠檬酸盐利用试验蓝绿色蓝绿色蓝绿色淀粉试验平板无菌落生长透明圈Icm硝酸盐还原实验无阳性反应无阳性反应无阳性反应A.3.4血清学鉴定A.3.4.1取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1：10稀释诊断血清1-2滴，第三格加12滴生理盐水。A.3.4.2无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。A.3.4.3同法取痢疾杆菌培养物少许，于第二格内混匀。A.3

10、.4.4轻轻摇动玻片，经Imin2min后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。A.3.5质谱图谱鉴定A.3.5.1微生物培养：将微生物按照其适宜的生长条件培养至生长对数后期，常见细菌和酵母一般培养24-48小时，用无菌接种环挑取5mg10mg新鲜的菌体于1.5m1离心管中，加入3001无菌水充分悬浮，加入9001无水乙醇，用涡旋振荡器震荡均匀，12000rpm离心2min-3min,弃上清后再次离心，用移液枪小心去除残余上清液，室温下干燥沉淀5分钟（乙醇挥发干即可）。A.3.5.2基质配制：称取15Inga

11、-鼠基-4-羟基肉桂酸(CHCA)于1.5m1心管中，加入1m1基质溶剂(乙睛：水：三氟乙酸=20：19：1,v/v/v),充分涡旋混匀，可置于4保存(注意，使用前应再次混匀，后静置Imin即可)。A.3.5.3点样：提取样IU1样品点至靶点中心，自然晾干后，再滴加11基质溶液上清覆盖样品，自然晾干，置于真空干燥靶箱中数秒即可。仪器参数设置为质量范围2000Da20000Da,采用337nm氮气激光器，脉冲延时450ns,靶高压19000V,脉冲高压1800V,MCP电压1480V,透镜高压2000V,激光能量3VJ6vJ,激光频率60Hz,单张谱图累加300次。A.3.5.4将采集到的指纹图

12、谱与建立的标准指纹图谱库进行检索比对，完成微生物的分类鉴定。A.3.616SrRNA基因细菌菌种鉴定A.3.6.1设计引物，一般使用16SrRNA通用引物序列1492R/F27,不同的种群有不同的引物，根据判断使用合适的引物序列。A.3.6.2取新鲜培养的细菌一个菌落或是11菌液作为模板，常规反应体系和反应条件即可。A.3.6.3扩增结束后用1%的琼脂糖凝胶电泳，检测条带的大小。经切胶回收后测序。A.3.6.4通用的五种16SrRNA基因PCR扩增引物见表A.2。表A.2通用的五种16SrRNA基因PCR扩增引物引物序列(5,-3,)适用范围fD1CcgaattcgtcgacaacAGAGTT

13、TGATCCTGGCTCAC大多数真细菌1D2CcgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCATGGCTCAC肠道细菌及其相关细菌fD3Ccgaat1cgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTTAGSpirochetes疏螺旋体fD4CcgaattcgtcgacaacAGAATTTGATCTTGGTTCAG衣原体属rP1CccgggatccaagcttACGGTTACCTTGTTACGACTT肠道细菌A.3.7M1ST鉴定直接从U1ST数据库(http:/PUbmISt.org)中获取分型方案，设计引物，用提取的基因组为模板，PCR扩增，采用一代或二代测序方法开展细菌M1

14、ST分型，测序结果直接在网站(http:PUbm1St.org)比对。A.3.8基因组鉴定提取细菌基因组DNA后，随机打断进行电泳回收，加上接头后进行DNA簇(CIUSter)制备，最后利用Paired-End(So1exa)或者Mate-Pair(SO1iD)的方法对插入片段进行测序。然后对测得的序列组装成Contig,通过PairCd-End的距离可进一步组装成SCaffOId,进而组装成染色体。基因组数字DNA-DNA杂交(dDDH),70%的阈值，当测试菌株基因组与某个模式菌株基因组dDDH70船则测试菌株基因组与该模式菌株属于同一物种。平均核甘酸相似性(AND表示两个基因组共享的同源

15、基因组之间的平均值,95-96%的AN1值等同于70%的DDH值，可以代替DDH作为物种划分的边界。A.4细菌鉴定流程细菌鉴定流程见图A.1。图A.1细菌鉴定流程附录B（规范性）病毒分离及鉴定方法与流程8- 1病毒接种8.1.1 根据病毒种类的不同，选用不同敏感细胞系或鸡胚接种。样本接种前一天将细胞传至24孔细胞培养板，次日细胞应至60%70%丰度。8.1.1.1 将待测毒种按1：10、1:100、1:1000倍稀释，稀释后的病毒1001接种细胞板。B.1.1.2置于不同病毒孵育的温度（33或37）、5%CO?培养箱吸附培养。B.1.1.3设置正常细胞作为对照。B.1.2观察CPEa）按上述方法将样本接种细胞后，每24h在倒置显微镜下观察CPE,CPE表现为细胞肿胀、变圆、脱落等。b） 以0%25%细胞CPE变化为“+”；c） 26%50%细胞CPE变化为