最新：VAMS与LC-MSMS技术联合及其临床应用的研究进展.docx

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1、最新：VAMS与1C-MS/MS技术联合及其临床应用的研究进展摘要体积吸收微量采样法(VAMS)采血量少、创伤小及便于运输，在临床采样中有着独特优势,液相色谱-串联质谱法(1C-MS/MS)检测具有特异性强、灵敏度高、高通量及样品用量少等优点，两种技术结合可推动家中采样，实现远程诊断，符合精准医学和个体化治疗的发展要求。该文主要介绍了VAMS技术及其与干血斑法(DBS)的比较，VAMS和1C-MS/MS联合应用情况和VAMS样品的处理。微量采样技术是一种收集微量(501)体液用于分析的技术,能促进生物分析小型化和微量化,尤其对血液收集友好,主要技术包括干血斑法(DBS)、体积吸收微量采样法(V

2、AMS)、毛细管微量采样法(CMS)和固相微萃取法(SPME)等,其中DBS与VAMS属于干血法,患者可利用这两种方法在家中收集血液样本彳寺样本干燥之后再运输检测,使生物分析远程化。因为DBS和VAMS微量采样的特点,所以需要联合应用具有特异性强且灵敏度高等特点的液相色谱-串联质谱法(1C-MS/MS)来检测。目前,国内外DBS与1C-MS/MS联合技术(DBS-1C-MS/MS)在新生儿筛查、治疗药物监测(TDM)、毒物动力学和药代动力学的临床应用和研究较多,而VAMS作为一种较新的技术,在国内研究较少,本文通过介绍VAMS优势,以及VAMS与1C-MS/MS联合技术(VAMS-1C-MS/

3、MS)的优势和主要应用,分析VAMS在国内开发应用的潜力和可行性。1 VAMS技术1.1 VAMS2014年QENNIFF等发布了介绍VAMS的相关论文XAMS作为一种较新的微量采样技术主要用于获取定量的血液或其他液体生物样本,并在装置中干燥后用于生物分析。VAMS研究中常用Mitra装置采样,Mitra装置的多孔聚合物尖端利用毛细管作用可吸收固定体积（10、201或301）的体液,如全血、血清、尿液和唾液等,并与塑料手柄组合便于操作。最具代表性的VAMS装置是由Neoteryx公司生产的Mitra装置）,采取血样时与液面呈45。,利用毛细血管作用收集定量的样品于尖端,几秒（与吸取的样体积相关

4、,通常为26S）后装置尖端充满变为红色,结束采样,室温干燥后邮寄实验室检测即可。VAMS的应用广泛,可用于采集药物、抗体、金属元素、兴奋剂及生物标志物等检测项目的生物样品。1.2 DBS将指尖或足跟等处穿刺得到的毛细血管血直接滴在专用的滤纸片上,干燥后截取血斑用于分析的采样方法称为DBS法,该方法是一种已经应用较成熟的微量采样技术,临床中多用于新生儿遗传性代谢障碍筛查采血。新出现的VAMS对于DBS用于定量生物样本时,可提供一种替代方法。1.3 VAMSDBS比较VAMS作为DBS的一种替代方法,首先,它们有着共同的优势,如采样量少、样品较稳定、可非冷藏运输和适合远程采样。其次XAMS有检测准

5、确性高的优势:VAMS能准确吸收固定体积的样品,其中Mitra装置采集的固定血量具有准确性和精确性,被美国食品药品监督管理局(FDA)归类为1类OVAMS装置可消除DBS采样时受到的血细胞比容(HCT)的影响。HCT指血细胞在全血中所占的容积百分比,影响血液黏度,从而影响固定体积血样滴加在滤纸片上的血斑大小,使打孔获得的血量不固定,检测结果发生偏倚,这是DBS定量血药浓度的主要难点。(2)提供标识。带有患者条形码的VAMS装置可在样品制备结束前不除去滞!J备过程中提供辨认样品的标志。最后XAMS相较于DBS存在一定劣势:(1)每个人操作存在差异,VAMS稳定性更差,在临床实践中,由有经验的采血

6、师从107位肾移植患者获得130份匹配的VAMS.DBS末梢血和静脉全血样本,经过筛选和确认,有32.3%的VAMS样品和6.2%的DBS样品质量不佳,但是ZIMMERMANN等收集5位W瘤患者家庭自行采样的24个VAMS样本都采集正确,可能是由于一人只采集1个VAMS样品会比一定时间内为一人采集3种匹配样本更容易和规范。因此,患者自己或其家属经过学习和大量训练可以解决采样问题。(2)一个Mitra装置的成本高于DBS卡或静脉穿刺工具包。DBS与VAMS共同的采样优点是对患者是友好的,而VAMS装置还可以准确吸收固定体积的样品,使检测结果更准确作为DBS的替代采样方法,有着很好的发展前景。1C

7、-MS/MS仪指由色谱技术与质谱技术联用的一种检测装置,色谱仪用于目标检测物在进入质谱仪之前的分离和浓缩,提高质谱检测的专一性和灵敏度,质谱仪用于鉴定和定量分析分离物,主要结构包括5部分:样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器和数据分析系统。1e-MS/MS不仅能同时检测多种物质而且灵敏度和准确度高,被认为是在有限体液量中小分子物质检测的金标准,如免疫抑制剂和其他窄治疗指数药物等,在临床可用于TDM、生物标志物检测和新生儿筛查等。1C-MS/MS检测用量少和灵敏度高的特点可适应VAMS微量采样的特点,两者结合运用于动物实验、远程采样J1童采血和其他不宜大量或需短期内多次采血的采样。以下主要介

8、绍VAMS技术在1C-MS/MS各种检测中的应用情况。2.1 动物实验应用VAMS设备采血量少、创伤性小,操作方便,符合动物实验3R原则(reduction,减少;rep1acement,替代;refinement,优化)。TH1RY等利用大鼠实验开发验证伊曲康嘤(ITZ)在VAMS和超高效液相色谱-串联质谱法(UP1C-MS/MS)结合的定量方法。药物监测实验须在不同的时间点抽取血液样本,获得药代动力学谱,评估ITZ制剂在大鼠体内的生物利用度。实验利用VAMS设备,每次收集大鼠尾部全血101(传统方法需采血0.2-0.5m1),整个采样过程约1min,对动物伤害小,采血量少,可多次采样,操作

9、简单,重复性好。虽然动物实验数据证明利用VAMS收集少量血液可以减少动物伤害,用于药物浓度、生物标志物和金属元素等监测具有可行性,但是实验中应用得仍然较少,没有充足的数据证明其没有误差,还需要更多的研究分析优化方法和消除VAMS采样的影响。2.2 临床应用VAMS可采集检测TDM、毒物动力学和药代动力学等多种类型的样品,以下主要介绍1C-MS/MS与VAMS技术结合采集血液样本进行血药浓度监测的应用,这是患者实现远程TDM的重要解决方案。2.2.1 免疫抑制剂检测移植物治疗患者受到自身免疫排斥反应的影响,需要服用免疫抑制剂缓解排斥反应,延长器官使用寿命。因为个体对药物代谢的差异大,且免疫抑制剂

10、的治疗窗口窄,所以患者需要定期到医院采集静脉血进行TDM才旨导临床用药以最小的危害达到最大的疗效。目前常用的免疫抑制剂有西罗莫司、他克莫司、依维莫司和环抱霉素A等,虽然静脉全血中检测这4种免疫抑制剂已在临床应用,但是引入VAMS采样方法采毛细血管血应用于临床还需要大量的研究及验证。KOSTER等已开发并验证使用VAMS作为取样装置采样,1C-MSMS同时定量样本中他克莫司、西罗莫司、依维莫司、环抱霉素A和霉酚酸的方法,检测结果的准确性和精密度符合要求且所有分析物可在25OC时至少稳定14d,证明VAMS储存样品稳定,为患者在家中采样邮寄医院检测提供了解决办法。研究人员比较了从移植患者同时收集的

11、VAMS采样毛细血管血和真空管采样静脉全血（检测患者体内的他克莫司血药浓度）,静脉全血和毛细血管血结果具有可比性和一致性,VAMS采血替代静脉采血具有可行性。VAMS采样与1C-MS/MS结合检测免疫抑制剂结果准确、灵敏、对移植患者伤害小、可实现家中采样邮寄检测。2.2.2 抗肿瘤药物检测癌症是人类死亡的主要原因,包括肺癌、胃癌、乳腺癌和白血病等。癌症患者可通过注射或口服抗肿瘤药物抑制肿瘤扩散或恶化,虽然口服抗肿瘤药物能方便患者的用药治疗,但是由于药代动力学的复杂性和个体差异性使个体血药浓度差异大,易发生不可控的不良反应,所以需要TDM控制给药到最佳治疗浓度。Verheijen等利用已建立1c

12、-ms/ms检测血样中依维莫司（可用于抗肿瘤和免疫抑制）浓度,准确度（11%）和精密度（14.6%）符合要求,在环境温度下,样品在VAMS设备上稳定至少362d。但是收集的10个临床用药患者的VAMS毛细血管血样本的检测结果高于静脉全血,需要使用公式计算出全血中的血药浓度。对于激酶抑制剂类抗肿瘤药物中甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、吉尔替尼和达拉法非尼等,研究者利用相应计算方法得到血浆、全血以及干燥血之间的血药浓度检测结果、转化关系,显示在VAMS收集的干燥血与全血和血浆1C-MS/MS检测有着良好相关性和一致性。随着口服抗肿瘤药物的TDM的发展并走向成熟,会推动微量采样技术与1C-MS/MS检测技

13、术的联合应用,实现远程采样。2.2.3 其他检测精神类药物在临床中治疗精神疾病也需要TDM,旨在将血药浓度控制在临床有用而不造成伤害的范围内,如治疗精神分裂症（氯氮平）、抑郁症（舍曲林、帕罗西汀和西配普兰）和癫痫（拉克沙胺、拉莫三嗪和左乙拉西坦）等药物。除了TDMzVAMS与1C-MS/MS联合应用还可以检测生物标志物、兴奋剂和抗生素等。2.3 VAMS在1C-MS/MS临床检测中的前处理用于1C-MS/MS检测之前VAMS装置中的样品需要经历采样、干燥、运输、储存和样品制备加工等步奏,整个样品采集、运输和前处理过程至少经手患者和检测人员,存在操作偶然性,这就需要通过优化VAMS的使用减少误差

14、,使两种技术的联用的检测结果更加准确可靠。采样:采样的不规范性可能导致装置尖端周围黏上样品,在样品未干时VAMS装置尖端接触到其他物品表面样品会丢失一部分,用潮湿或油腻的手指错误地接触VAMS装置尖端使液体进入装置占用体积等造成吸样量偏差等。这些操作上的失误可以通过对操作者的教学和培训来减少,如定期操作培训、录制教学视频和采样注意事项公众号日常推送等。(2)干燥:装置内的样品需晾干后检测和运输,干燥条件会影响到后期样品的提取,一般室温下干燥,而干燥的时间会根据样品类型和吸样量不同而改变,需要避免不当干燥和样品污染。(3)运输和储存:运输过程中由于干燥血中样品具有稳定性一般只需要保存在带有干燥剂

15、的密封袋中常温运输,样品长时间无法分析时可以包装袋形式冷藏保存,使样品稳定。样品制备加工:样品前处理是两种技术联用的关键步骤,影响后续检测。样品中检测物提取纯化的主要方法包括液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取等。常用有机溶剂甲醇和乙睛,YE等对美托洛尔和咪达嗖仑等具有疏水性的模型药物从VAMS干燥血样中的提取回收率进行评估彳导到高疏水化合物使用单纯甲醇或甲醇乙睛混合液萃取的回收率高于甲醇水溶液或乙睛水溶液萃取回收率的结论。这是因为水会降低有机溶剂的洗脱强度而影响回收率。实际操作中前处理条件不够完善时,HCT会对VAMS的提取回收率产生影响,HCT与提取回收率呈反比,可能是由于高HCT的大量红细胞易堵

16、塞VAMS尖端孔隙,分析物的提取受阻导致提取回收率下降。因此,选择合适的提取试剂及萃取分离方法,使VAMS中的样本完全洗脱和释放出待测物,提高提取回收率对于提升样品检测结果的准确度十分重要。3.1 主要优势VAMS为1C-MS/MS的检测项目提供远程微量采样工具,与传统采样方法相比,VAMS可减小TDM、毒物动力学、药代动力学等研究需要多次采样造成的伤害;避免临床常规静脉采血的老人、新生儿及其他不宜大量采血患者的不良反应;提供有不宜出门（如新型冠状病毒感染疫情期间）、距离实验室很远和不愿意到医院采样等情况的人群一种方便易学的采样方法等。SCUDERI等调查肾移植患者对静脉采血和手指末梢采样看法的结果也显示,85%的参与者更喜欢手指采样,95%的参与者对在家中手指采样感兴趣,可以看出大部分肾移植患者愿意接受末梢采血代替静脉采血,末梢采血的VAMS在患者中推行具有优势和可行性。1C-MS/MS除了具有高通量、灵敏度和准确度高,可