人新基因EOLA1与MT2A相互作用.docx

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1、收件日期：受理编号：申请代码:受理部门:检查保护国家自然科学基金申请书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：1）如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:“中“方法:Word菜单工具-宏，安全性,安全级,设置为“中“（如果您是Wor（197用户，继续执行以下步骤）2）关闭本文档，重新打开本文档3）点击，启用宏”按钮，即可开始填写本文档或打印了申报日期：2006年3月15日国家自然科学基金委员会基本信息申请者信息姓名在此录入修改性别生月出年年月民族学位职称主要研究领域电话电子邮件传真个人网页工作单位在研项目批准号依托单位信息名称在此录入修改代码联系人

2、电子邮件电话网站地址合作单位信息单位名称代码在此录入修改在此录入修改项目基本信息项目名称人新基因EO1AI与MT2A相互作用关系研究资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明申请代码C03030308:创伤外科与烧伤外科学基地类别成都医学院中心实验室部门开放预计研究年限2007年1月2010年1月研究属性基础研究摘要(限400字)：内皮活化相关新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(endothe1Ia1-Overexpressed1PSassociatedfactor1,EO1A1)系2002年发现的人类新基因，初步的研究结果表明该基因的表达和1PS刺激血管内皮细胞有关，可能参与了血管内皮细胞的

3、活化进而引起内皮细胞损伤的过程。阐明疾病相关新基因的功能是后基因组时代的一个重要研究方向。蛋白质相互作用研究是研究基因功能的一个有效途径。我们前期应用酵母双杂交技术发现EO1A1和金属硫蛋白2A(meta1Iothionein2A)存在相互作用关系。机体内的各种生物学过程最终要靠蛋白质之间的相互作用来完成，存在直接相互作用的蛋白质在功能上往往密切相关，深入研究EO1A1和MT2A的相互作用关系可以进一步了解人类新基因EO1A1的功能及其在内皮细胞活化过程中的功能角色，有助于深入了解内皮细胞的活化机制。关键词(用分号分开，最多5个)内皮细胞；新基因；蛋白质相互作用；金属硫蛋白项目组主要成员（注：

4、项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮件项目分工工间1年时月每作I1（修改2在此录入修改3在此录入修改4在此录入修改5修改6在此录入修改7在此录入修改8在此录入修改9在此录入修改总人数高级中级初级博士后博1:生硕士生6132说明：高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。版本1.004.262科目申请经费备注(计算依据与说明)一.研究经费21.50001.科研业务费6.0000(1)测试/计算/分析费4.0000实验结果测试及数据处理(2)能源/动力费0.5000水

5、、电，设备磨损(3)会议费/差旅费0.5000学术交流(4)出版物/文献/信息传播费0.5000文献查新、复印、发表论文(5)其它0.5000实验室卫生、垃圾处理等2.实验材料费10.0000(1)原材料/试剂/药品购置费10.0000酵母双杂交系统、免疫共沉淀系统、单克隆抗体等试剂(2)其它3.仪器设备费4.0000(1)购置4.0000适当购置小型设备(如凝胶电泳耗材等)(2)试制4.实验室改装费1.0000细胞培养及分子生物实验室维修5.协作费0.5000二.国际合作与交流费0.00001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流三.劳务费2.5000四.管理费1.0000合计25

6、.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助(含部门匹配)其他经费来源合计0.0000(金额单位：万元)经费申请表查看报告正文撰写提纲I报告正文1立项依据与研究内容11项目的立项依据大量的研究结果表明血管内皮细胞损伤既是诱发机体发生凝血障碍、休克和多脏器损伤等严重病症的重要因素，又是这些疾病的基本病理改变之一。内皮细胞过度活化引起的失控性炎症反应是血管内皮细胞损伤的病理基础。目前已经知道缺血、缺氧及内毒素等刺激都可以使内皮细胞处于应激状态，但对于内皮细胞的活化及其调控机制还不清楚。内皮活化相关新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(endothe1ia1-overexpres

7、sed1PSassociatedfactor1,EO1A系2002年发现的人类新基因，初步的研究结果表明该基因的表达和1PS刺激血管内皮细胞有关，可能参与了血管内皮细胞的活化进而引起内皮细胞损伤的过程。阐明疾病相关新基因的功能是后基因组时代的一个重要研窕方向。蛋白质相互作用研究是研究基因功能的一个有效途径。我们前期应用酵母双杂交技术发现Ee)1AI和金属硫蛋白2A(meta11othionein;MT2A)存在相互作用，并应用免疫共沉淀技术对其相互作用关系进行了验证。金属硫蛋白是体内比较保守的蛋白质家族，这些蛋白的诱导和表达和机体抗DNA损伤、氧化应激保护及细胞凋亡调控有关。目前的研究表明MT

8、2A还与细胞的增殖分化存在紧密的联系，在多种癌组织中发现MT2A过度表达，MT2A有可能成为新的肿瘤标志物。机体内的各种生物学过程最终要靠蛋白质之间的相互作用来完成，存在直接相互作用的蛋白质在功能上往往密切相关，深入研究Eo1AI和MT2A的相互作用关系可以进一步了解人类新基因EO1A/的功能及其在内皮细胞活化过程中的功能角色，有助于深入了解内皮细胞的活化机制。近年来蛋白质相互作用研究技术有了长足发展，其中酵母双杂交技术以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。以酵母双杂交技术为基础发展起来的高通量生物学技术使得绘制蛋白质相互作用

9、图谱成为可能。酵母双杂交为蛋白质功能研究提供了巨大帮助，继酵母双杂交之后，人类又发现了RNA干扰现象，为研究蛋白质功能又提供了一有力工具。从2001年Nature杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通过SiRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默后，RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。2003年RubinsonDA等又在NatUreGenetiCS上报道用病毒系统在原代哺乳动物细胞，干细胞和转基因小鼠上都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围。研究者们可以利用这项技术对目标基因进行特异性地表达沉默，通过观察其表达被抑制后细胞以至生物体从形态到

10、各项生理生化的变化，对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多，因此短短几年，就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相关的一些基因，不仅对疾病机制及相关代谢网络有了进一步认识，也为基因治疗及药物筛选提供了一些借鉴。充分利用当前蛋白质功能研究技术可以从多方面对一新基因的功能进行探讨，从而为揭示其功能奠定基础。1.2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题1.2.1 研究内容和研究目标1.2.1.1 EO1A1与MT2A相互作用位点及其在细胞内的共定位情况应用酵母双杂交系统确定EO1A1与MT2A相互作用位点，通过位点基因序列推导出其对应的氨基

11、酸序列，了解其相互作用位点模式，从而为了解Ee)1A1功能提供信息。利用绿色荧光蛋白载体(EGFP)构建EGFP-EO1A1共表达载体，转染人脐带血管内皮细胞，双抗染色后在激光共聚焦下观察其在细胞内的定位。1.2.1.2 Eo1AI与MT2A的上下游关系应用强制表达技术和RNA干扰(RNAi)技术建立人脐带血管内皮细胞EO1A1强制表达和下调表达模型，分别检测两模型MT2A的表达情况，根据两细胞模型MT2A的表达情况确定Ee)1A1是否参与调解MT2A的表达。采用同样手段了解MT2A是否参与调解Eo1AI的表达。通过上述研究来了解Eo1AI和MT2A的上下游关系。1.2.1.3 EO1AI是否

12、参与了内皮细胞的应激反应过程用1PS刺激人脐带血管内皮细胞EO1AI强制表达和下调表达模型及未经转染的内皮细胞，应用E1ISA技术检测三类细胞相关炎症因子的表达强度，从而推测EC)1A1是否参与了1PS激活内皮细胞的过程。1.2.1.4 Eo1AI和MT2A的相互作用和内皮细胞凋亡、分化及增殖的关系很多文献表明MT2A参与调解细胞周期，与细胞凋亡、分化和增殖关系密切。EC)1AI与MT2A存在相互作用，他们之间的相互作用是否参与了细胞凋亡、分化和增殖的调解。1.2.2拟解决的关键问题拟通过本研究明确EO1AI与MT2A之间的相互作用位点和相关作用模式，确定EO1A1是否参与了内皮细胞的应激反应

13、过程，了解EO1A1是否参与了细胞周期的调控，从而为明确EO1AI的功能打下基础。1. 3拟采取的研究方案及可行性分析技术路线1.1.1 构建一系列Eo1A1截短体融合表达诱饵载体，利用酵母双杂交技术确定Eo1A1和MT2A相互作用位点；1.1.2 构建绿色荧光蛋白EO1AI融合表达载体并转染内皮细胞，双抗染色后在激光共聚焦显微镜下观察EO1AI和MT2A共定位情况；1.1.3 构建EO1AI和MT2A可控强制表达载体并转染内皮细胞，等剂量1PS分别刺激EO1AI强制表达细胞和正常表达细胞，EUSA检测TNF-、I1-6等细胞因子的表达情况；同时应用RT-PCR和WeSternb1ot技术检测

14、两组细胞MT2A的表达情况；1.1.4 4应用RNAi(RNA干扰)技术，建立EO1AI和MT2A下调表达内皮细胞株，等剂量1PS分别刺激EO1A1下调表达株和正常表达株，检测TNF-a、I1-6等细胞因子的表达情况;同时检测两组细胞MT2A的表达情况；1.3.5应用构建的载体分别建立EO1A1下调表达一MT2A正常表达、EO1AI强制表达一MT2A正常表达、Eo1A1下调表达一MT2A强制表达、Eo1A1下调表达一MT2A下调表达等细胞模型，应用细胞计数和流式细胞仪的方法观察这些模型细胞周期的改变，应用DNA电泳的方法观察细胞凋亡情况。主要技术路线示意图：(1) MT2A与EO1AI相互作用位点的确定州选完展，fiMr2A与EO1A1相互作用位点(2) Eo1AI和MT2A共定位EGFPEO1A1