miRNA-18a和miRNA-4802通过自噬抑制淋巴瘤细胞耐药性的机制研究_1.docx

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1、miRNA-18a和miRNA-4802通过自噬抑制淋巴瘤细胞耐药性的机制研究周仕霞李晓明唐君玲关键词淋巴瘤细胞；耐药性;niiRNA-18a；miRNA-4802；自噬；机制淋巴瘤尤其非霍奇金淋巴瘤是危害人类健康的重大疾病1。淋巴瘤患者在临床上常使用环磷酰胺、阿霉素(adriamycin, ADR)、长春新碱(vincristine, VCR)和博来霉素等的联合化疗方案进行治疗；近年来，单克隆抗体靶向药物的发展也大大改善了淋巴瘤患者的临床治疗现状然而，在临床治疗过程中，淋巴瘤细胞的耐药性会严重威胁化疗效果和患者预后4-6。所以，阐明淋巴瘤细胞的耐药机制具有重要的临床应用价值。自噬是细胞在环境

2、压力条件下进行的一种非常重要的细胞代谢机制,呈现高度的进化保守性7。相关研究表明，在淋巴瘤中，自噬介导的细胞凋亡是多种化疗药物的重要作用机制8T0；然而，也有研究表明，自噬可以显著增强淋巴瘤细胞对特定单一化疗药物或多种化疗药物的耐药性11-14,但其具体分子机制尚不明确。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类非编码小分子RNA,其在基因表达调控领域中起着重要作用。本课题组前期研究发现，miRNA-18a.miRNA-4802与细胞耐药性之间存在相关性。基于此，本研究以人Burkitt, s淋巴瘤细胞和人套细胞淋巴瘤细胞为研究对象，使用ADR和VCR进行处理，再以miRNA-18a

3、、miRNA-4802以及细胞自噬作为研究切入点，探讨2个miRNA对淋巴瘤细胞耐药性的影响及调控机制,以期为淋巴瘤耐药性的机制阐明及淋巴瘤治疗药物开发提供参考，同时也为淋巴瘤的临床治疗提供新的潜在靶点。1材料LI主要仪器本研究所用主要仪器有HR40-A2型生物安全柜（海尔集团公司），GX53型倒置荧光显微镜、BX53M型正置荧光显微镜（日本Olympus公司），SC06AD-2型二氧化碳培养箱、Milli-Q型水纯化系统、ST40R型低温离心机（美国ThermoFisherScientific公司），TGLT6M型常温离心机、DK8D型恒温水浴锅（湖南湘仪科教仪器有限公司）,TriStar2

4、LB942型多功能微孔板酶标仪（北京科瑞恩特科技有限公司），12kVHT7800型透射电镜柜谷科技发展（上海）有限公司。1.2主要药品与试剂RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清（批号分别为11875-093、26010066）购于美国ThermoFisherScientific公司；细胞增殖检测试剂盒（批号CK04）购于北仁化学科技（北京）有限公司；细胞裂解液、Ad-mCherry-GFP-LC3 腺病毒（批号分别为 20220407、CA100008M）均购于上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人微管相关蛋白（microtubule-associatedproteinlightchain3,

5、LC3）单克隆抗体、兔抗人p62单克隆抗体、兔抗人8-肌动蛋白（B-actin）单克隆抗体（批号分别为14600-l-AP、KHC0058 23660-1-AP）均购于武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗人unc-51样激酶（ULK1）单克隆抗体、兔抗人自噬相关蛋白7 （ATG7）单克隆抗体、兔抗人活化型胱天蛋白酶9 （cleavedcaspase-9）单克隆抗体、兔抗人 cleavedcaspase-6 单克隆抗体（批号分别为 A7481、A2856、SAB4503337. SAB4500330）均购于美国Sigma公司；模拟生物体内源的miRNAs （miRNAmimics,批号AF04-202

6、21004）购于上海生工生物工程有限公司。其余试剂为实验室常用规格，水为超纯水。1.3细胞人Burkitt s淋巴瘤细胞Daudi和人套细胞淋巴瘤细胞JeKo-l均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。2方法2. 1细胞培养Daudi细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，JeKo-1细胞培养于含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。2种细胞均置于37. 5%C02. 95%湿度的培养箱中进行培养。细胞呈单个悬浮生长。2. 2Daudi细胞和JeKo-1细胞对ADR和VCR耐药性的考察将Daudi细胞和JeKo-1细胞以2000个/孔接种于96孔板中，分别分为对照组、

7、ADR组（lgmL,质量浓度设置参考前期预实验结果）、VCR组（lgmL,质量浓度设置参考前期预实验结果），另设不加细胞只加培养基的空白组，每组设10个复孔。对照组加入磷酸盐缓冲液100 L,其余各给药组加入相应药液100 L,培养72h后，各组加入CCK-8试剂10uL,继续培养1.5ho采用酶标仪于450nm波长处检测各组吸光度（0D）值，并计算细胞的相对活性相对活性二（给药组0D-空白组0D） / （对照组0D-空白组0D） o相对活性检测结束后，采用Westernblot法进行2种凋亡标志蛋白表达水平的检测。取ADR组、VCR组细胞适量，以细胞裂解液提取总蛋白，经变性后，进行十二烷基硫

8、酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳，然后进行封闭、孵育抗体、显影等操作，以检测2种细胞中cleavedcaspase-9 和 cleavedcaspase-6 的表达水平（以 -actin蛋白为内参）。2. 3Daudi幺田胞和JeKo-1细胞自噬活性的考察2.3. 12种自噬相关蛋白表达水平检测取Daudi细胞和JeKoT细胞适量，以细胞裂解液提取总蛋白，按“22”项下Westernblot法操作，检测2种细胞中LC3TI、p62蛋白的表达水平（以B-actin蛋白为内参）。2. 3.2自噬流实验取Daudi细胞和JeKo-1细胞适量，接种于装有细胞爬片（已经多聚赖氨酸处理）的24孔板

9、内，待细胞融合度为60%70%时，将培养基换成不含双抗的完全培养基，并根据预实验确定的最佳感染复数值加入适量Ad-mCherry-GFP-LC3腺病毒溶液,感染48h后，取出细胞爬片，并以磷酸盐缓冲液清洗3次;于载玻片上滴加适量防荧光猝灭剂，并将细胞爬片（有细胞的一面）覆于其之上，再采用荧光显微镜观察LC3-II蛋白的分布和形态。2. 3. 3透射电镜观察取Daudi细胞和JeKo-1细胞适量，经消化、离心后收集细胞，以2.5%戊二醛溶液固定24h,再以1%钺酸溶液固定3h后，于4匕条件下进行梯度脱水、包埋、固化、切片（厚度为70nm）；将切片以3%醋酸铀-枸椽酸铅溶液染色6h后，采用透射电镜

10、观察2种细胞中的自噬溶酶体并计数。2. 4Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞中 niiRNA-18a、miRNA-4802 和 ULKkATG7的表达差异考察Daudi细胞和JeKo-1细胞适量，使用试剂盒提取2种细胞的总RNA,再分别使用相应试剂盒进行miRNA-18a和miRNA-4802. ULK1和ATG7的逆转录，合成相应cDNA；再以cDNA为模板，进行荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）,具体引物序列见表10PCR反应体系（共10uL）：TBGreen PremixExTaqTM 5 L,上下游引物各 0.4L, cDNA 模板1 L,水3.2L0反应条件：95预变性50

11、1管；95。（2变性15s, 58退火30s, 72延伸60s,循环39次。采用2-Ct法计算miRNAT8a、miRNA-4802和ULK1、Atg7mRNA的表蓬水平。另夕卜,取Daudi细胞和JeKo-1细胞适量，以细胞裂解液提取总蛋白，按“2.2”项下Westernblot法操作，检测2种细胞中ULK1、ATG7蛋白的表达水平（以B-actin蛋白为内参）。2. 5JeKo-l细胞经miRNA-18amimics处理后自噬活性的变化考察将 JeKo-1 细胞分为 Controlmimics 处理组和 miRNA-18amimics 处理组，miRNA-18amimics处理组细胞加入m

12、iRNA- 18amimics适量进行转染（Controlmimics处理组不作任何处理）。然后取2组细胞适量，分别进行Westernblot实验（以检测各组细胞中ULK1、分3-11、p62蛋白的表达水平）、自噬流实验（以检测各组细胞中LC3-蛋白的分布和形态）、透射电镜观察（以检测各组细胞中自噬溶酶体的数量）。2. 6JeKo-l细胞经miRNA-4802mimics处理后自噬活性的变化考察将JeKo-1 细胞分为 Controlmimics 处理组和 miRNA-4802mimics 处理组,同“2.5”项下方法处理并进行相应实验（其中Westernblot实验中检测ATG7、LC3-I

13、I、p62蛋白的表达水平）。2. 7JeKo-1 细胞经 miRNA-18amimics 和 miRNA-4802mimics 处理后耐药性的变化考察取JeKo-l细胞适量，以ADR（lgmL）干预后，分为 Controlmimics 处理组、miRNA-18amimics 处理组、miRNA-4802mimics 处理组。另取 JeKoT 细胞适量,以 VCR（1 gmL）干预后，同样分为上述3组。各组细胞按“2. 5”项下方法处理后，再按“2. 2”项下方法检测细胞相对活性和凋亡标志蛋白cleavedcaspase_9 cleavedcaspase_6 的表达水平。2. 8统计学方法采用S

14、PSS19. 0统计软件进行分析,数据以xs表示,多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准 =0. 05o3结果3. IDaudi细胞和JeKo-1细胞对ADR和VCR的耐药性考察结果经ADR处理后，Daudi细胞和JeKo-1细胞的相对活性与其各自的对照组相比分别降低至51%和70% (P0. 001)；经丫。?处理后，Daudi细胞和JeKo-1细胞的相对活性分别降低至41%和72% (P0. 001 )oWesternblot实验结果显示,经ADR、VCR处理后，Daudi细胞中凋亡标志蛋白cleavedcaspase_9 cleavedcaspase-6的

15、表达水平均显著高于JeKo-1细胞(P0.01或P0.001)。结果见图1。这表明,与Daudi细胞相比，JeKo-1细胞对ADR和VCR具有更强的耐药性。3. 2Daudi细胞和JeKo-1细胞自噬活性的考察结果Westernblot实验结果显示，与Daudi细胞相比，JeKo-1细胞中LC3-蛋白的表达水平显著升高，p62蛋白的表达水平显著降低(P0. 001)o自噬流实验结果显示，JeKo-l细胞中LC3-蛋白的荧光斑块明显，自噬活性较强;Daudi细胞中LC3-H蛋白荧光斑块不明显，自噬活性较弱。透射电镜观察结果显示，与Daudi细胞自噬溶酶体数量为(0.20. 1)个相比，JeKo-1细胞中自噬溶酶体数量(2.4 + 0. 1)个显著增多(P0.01)o结果见图2o这表明，JeKo-1细胞的自噬活性显著高于Daudi细胞。3. 3Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞中 miRNA-18a. miRNA-4802 和 ULK1、ATG7的表达差异考察结果qRT-PCR实验结果显示，Daudi细胞